Г. А. Пенькова, А. А. Филиппов, И. Л. Голованова, Е. С. Степина
Ртуть занимает одно из ведущих мест среди тяжелых металлов, оказывающих токсическое воздействие на живые организмы. Она принадлежит к числу тиоловых ядов, блокирующих сульфгидрильные группы белков, входящих в состав важнейших для организма ферментов. Ртуть также реагирует с -СООН и -NH2 группами белков с образованием прочных комплексов - металлопротеинов. Нарушение нормальной работы белков-ферментов приводит к глубоким нарушениям в организме, и прежде всего, в центральной нервной системе и в почках.
Продолжительность жизни ртути в атмосфере невелика (несколько дней), однако в почве и воде она составляет сотни тысяч лет [9]. Наиболее токсичны органические соединения ртути, в состав которых входит метиловая группа. Поступая в организм с водой и пищей, метилртуть мигрирует по пищевым цепям как в водной, так и в наземно-воздушной среде, вызывая специфические отравления и заболевания у человека и животных. В то же время показано, что в малых количествах ртуть увеличивает иммунологическую устойчивость организма [10], а также повышает линейно-массовые размеры у рыб [1, 3].
Установлено, что ртуть вызывает значительные изменения белкового, липидного и углеводного обменов у позвоночных [3, 7]. Соединения ртути влияют на активность всех мембранных ферментов, в том числе и митохондриальных, участвующих в процессах энергопродукции [7]. При действии ртути у млекопитающих выявлены изменения активности антиоксидантных ферментов в печени и почках [12], а также изменения активности аргиназы и митоген- активируемой протеинкиназы [13, 14]. Накопление ртути, поступающей с пищей, вызывает разнонаправленные изменения активности и кинетических характеристик пищеварительных гли- козидаз рыб [2, 4, 6].
Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене, для оценки физиолого-биохимического состояния в условиях антропогенного загрязнения особую актуальность представляет изучение влияния ртути на гидролиз углеводов в кишечнике животных. В то же время действие накопленной в организме ртути на пищеварительные ферменты млекопитающих из природных популяций изучено крайне слабо [8]. Рыжая полевка - мелкий мышевидный грызун - характеризуется высокой численностью, коротким жизненным циклом (до 750 дней) и высокой скоростью метаболизма. Она является удобным объектом для изучения влияния ртути на переваривание углеводов, поскольку в ее рационе преобладают семена различных трав и деревьев, лесные ягоды, зелёные части растений.
В связи с этим цель работы состояла в изучении влияния накопленной в кишечнике ртути на активность гликозидаз в тканях и содержимом кишечника рыжей полевки Myodes glareolus Schreber из различных биотопов Воронежского заповедника.
Материалы и методы
Рыжие полевки средней массой 16-22 г отловлены осенью 2009 г. на разных биотопах (ольшаник, дубрава, осинник) Воронежского Биосферного заповедника. Ольшаник - наиболее влажный участок, затопляемый в половодье р. Усмань, дубрава - обширный участок склона (угол наклона < 4 градусов) к руслу реки, осинник расположен выше дубравы по склону.
Полевок отлавливали с помощью давилок Ге- ро на стандартную приманку - хлеб, обжаренный в подсолнечном масле. На каждом биотопе выставляли по 50 давилок (на 10 дней) на расстоянии 5 м друг от друга. После поимки зверьков взвешивали и проводили биологический анализ. Кишечники изымали и хранили при температуре -18°С не более двух недель. Всего в работе использовано 40 особей, разделенных на группы по половой принадлежности и содержанию ртути в стенке кишечника.
В лабораторных условиях кишечник очищали от жира и прилегающих тканей, отделяли медиальную часть кишечника и разрезали ее вдоль. При помощи пластмассового скребка удаляли химус, а слизистую оболочку кишечника промывали охлажденным до 2-4°С раствором Рингера для теплокровных животных (152 ммоль NaCl, 5,7 ммоль KCl, 26 ммоль CaCl2, 1,8 ммоль NaHCO3, рН 7,4) для удаления остатков химуса. Кишечную стенку, наряду с химусом, использовали для приготовления исходного гомогената. Пробы ферментативно-активных препаратов готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4°С раствор. Растворы субстратов (1,8 % крахмала и 50 ммоль сахароза) готовили на таком же растворе Ринге- ра. Гомогенаты и растворы субстратов инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 или 60 мин при температуре 20°С, рН 7,4.
В стенке и химусе кишечника определяли in vitro активность гликозидаз: мальтазы КФ 3.2.1.20 (глюкозооксидазный метод), сахаразы КФ 3.2.1.48 (метод Нельсона), а также амилоли- тическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал: а-амилазы, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20 (метод Нельсона) [11]. Для определения активности мальтазы применяли набор для клинической биохимии «Фотоглюкоза» (ООО «Импакт», Россия). Ферментативную активность определяли в пяти повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/г-мин). Определение ртути проводили атомно-абсорбционным методом с использованием анализатора ртути РА-915. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05.
Результаты и обсуждение
Наибольшее накопление ртути в стенке кишечника и химусе рыжей полевки из дубравы и ольшаника существенно превышало аналогичные показатели у грызунов из более сухого биотопа осинник (табл. 1, 2). У отдельных самцов из дубравы содержание ртути достигало 60 мкг/кг сырой массы кишки и 126 мкг/кг сырой массы химуса. Содержание ртути в почвах исследованных биотопов снижалось в ряду ольшаник > дубрава > осинник [5] и положительно коррелировало с накоплением ртути в кишечнике (r = 0,77) и химусе (r = 0,60) самок. Наибольшие различия в уровне накопления ртути также отмечены у особей более влажных биотопов: содержание ртути в кишечнике различалось в 43 раза, в химусе - в 84 раза, в то время как у особей из осинника - лишь в 3 и 18 раз соответственно.
Уровень активности гликозидаз в тканях и химусе кишечника полевок достаточно высок, что хорошо согласуется с высоким содержанием углеводов в пище этих животных. Сравнение ферментативной активности у самцов и самок с близким содержанием ртути в кишечнике внутри одного биотопа позволило выявить половые различия (табл. 1). Так, при меньшем уровне накопления ртути у самок из осинника амилолитиче- ская активность и активность мальтазы выше на 38 и 29 %, активность сахаразы, напротив, ниже на 33 %, чем у самцов. У самок из ольшаника амилолитическая активность на 19 % ниже по сравнению с самцами, активность мальтазы и сахаразы примерно равна. Амилолитическая активность в химусе самок из осинника и ольшаника на 40 и 23 % ниже, чем у самцов, изменения активности других гликозидаз менее выражены (табл. 2). При более высоком уровне накопления ртути активность исследованных ферментов в стенке кишки и химусе у самок в большинстве случаев ниже, чем у самцов.
При анализе влияния накопленной ртути на активность гликозидаз у полевок с разных биотопов показаны разнонаправленные изменения амилолитической активности (табл. 1). У самцов по мере накопления ртути отмечено как увеличение (на 10-87 %, ольшаник, осинник), так и снижение (на 20 %, дубрава) ферментативной активности. У самок достоверное увеличение амилолитической активности на 41 % отмечено лишь в дубраве. Активность сахаразы в большинстве случаев снижается (на 16-48 %), лишь у самцов из ольшаника отмечено увеличение ферментативной активности на 40 %. Статистически достоверные изменения активности мальтазы с увеличением содержания ртути в кишечнике отмечены лишь у полёвок из ольшаника: у самцов она увеличивается на 11 %, а у самок снижается на 13 %.
Таблица 1
Влияние накопленной ртути на активность гликозидаз слизистой оболочки кишечника рыжей полевки
из различных биотопов
| Биотоп | Пол | n, | Hg, мкг/кг сырой | Ферментативная активность, ммоль/г-мин | ||
| экз. | массы кишечника | Амилолитическая | Сахараза | Мальтаза | ||
| Ольшаник | в | 7 3 | 5,4 ± 0,7 25,7 ± 1,8 *** | 28,00 ± 0,62 30,67 ± 0,85 * | 3,89 ± 0,09 5,44 ± 0,25 *** | 8,08 ± 0,17 9,00 ± 0,10 ** |
| ? | 3 4 | 4,2 ± 1,5 24,3 ± 5,0 ** | 22,67 ± 0,30 21,60 ± 1,03 | 4,27 ± 0,13 3,60 ± 0,18 * | 8,67 ± 0,16 7,58 ± 0,08 *** | |
| Дубрава | в | 2 4 | 5,5 ± 0,8 35,3 ± 9,5 * | 24,07 ± 0,67 19,27 ± 0,54 ** | 3,57 ± 0,15 2,53 ± 0,06 *** | 7.92± 0,29 7.92± 0,26 |
| ? | 2 3 | 12,0 ±0,0 19,7 ± 1,8 * | 15,40 ± 0,64 21,73 ± 0,58 *** | 2,96 ± 0,08 2,88 ± 0,14 | 7,75 ± 0,10 7,58 ± 0,44 | |
| Осинник | в | 3 3 | 3,4 ± 0,0 8,3 ± 0,4 *** | 15,11 ± 0,12 28,33 ± 0,91 *** | 9,20 ± 1,18 4,77 ± 0,07 ** | 5,96 ± 0,13 6,38 ± 0,13 |
| ? | 3 3 | 3.8± 0,4 6.8± 1,6 | 20,89 ± 0,49 20,40 ± 0,95 | 6,20 ± 0,03 4,43 ± 0,01 *** | 8,09 ± 0,13 8,26 ± 0,10 | |
Примечание. Здесь и в табл. 2. В числителе группа с меньшим содержанием ртути, в знаменателе - с большим содержанием ртути; различия показателей у особей с разным содержанием ртути внутри одного биотопа статистически достоверны: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001); n - количество исследованных особей, экз.
Сравнительный анализ активности гликозидаз у полевок одного биотопа при низком содержании ртути показал, что амилолитическая активность в химусе у самок ниже, чем у самцов на 22-40 % (табл. 2). Различия в активности сахаразы и мальтазы носят разнонаправленный характер.
С ростом накопления ртути в химусе рыжей полевки отмечены разнонаправленные изменения активности всех изученных ферментов. Максимальное увеличение амилолитической активности на 97-99 % отмечено у особей обоего пола из ольшаника.