Выше уже говорилось отом, что раствор гемоглобина при введении его в кровоток резкоувеличивает онкотическое давление, тем самым изменяя гемодинамику. Однако,согласно последним данным, полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой 600000 при концентрации 6г/100 мл обнаруживает сравнительно небольшоеонкотическое давление крови порядка 20 мм. рт. ст., что близко к онкотическому давлению крови. Но при концентрации 12г/100мл раствор такого гемоглобинаимел онкотическое давление 40 мм. рт. ст. Но в Америке (A.G. Greenburg)создан гемоглобин с молекулярной массой 1млн., который даже в концентрации14г/100 мл обусловливал онкотическое давление 20 мм рт. ст. При такойконцентрации раствор имеет кислородную емкость, равную таковой для цельной крови.
Известно, что с помощью пиридоксальфосфата Р50 полимеризованного гемоглобина онкотическоедавление может быть повышено с 15 - 20 до 28 - 30 мм рт. ст. и выше. При специальных мерах предосторожности такие препараты могут сохранять своикислородпереносящие свойства в течение 2 -12 месяцев при образовании метгемоглобина не более 0,6% в месяц.
В современной литературепо этой проблеме встречаются мнения о том, что полимеризованный гемоглобин сбольшой и очень большой молекулярной массой является первым реальным кандидатомна преклинические и клинические испытания. Но возникают проблемы, без решениякоторых нельзя приступать к клиническим испытаниям.
Одна из таких проблем -неясность судьбы этих гигантских молекул в организме.
Предполагают, что ониразрушаются в ретикулоэндотелиальной системе опсонинами плазмы и макрофагами. Это, по мнению Greenburg, "отвлекает" иммунологическиемеханизмы от выполнения прямых задач и ослабляет иммунологическую защиту.Кроме того, при массивных инфузиях гигантские молекулы оказывают токсическоедействие на ткани как самой молекулой, так и образующимися метгемоглобином идимерами гемоглобина. Внеэритроцитарный гемоглобин слишком быстро выводится изкровеносного русла [6].
В настоящее времяобсуждаются следующие пути решения этой проблемы: моделирование эритроцитовпутем микрокапсулирования растворов гемоглобина; химическая модификациягемоглобина с получением полигемоглобина и его конъюгатов с биополимерами;внутримолекулярная модификация гемоглобина, препятствующая его диссоциациина димеры.
Важным направлением всовременном развитии проблемы создания "искусственной крови" является создание неких микротелец или микрокапсул, содержащих гемоглобин.Тяжелые физиологические последствия разрушения эритроцитов известны давно, иеще в 1971 г. были сделаны первые попытки создания искусственных эритроцитов ввиде твердых нейлоновых капсул с гемоглобином (T. Chang). Но первые опыты былинеудачны, а перспективную идею вывели из небытия совсем недавно M.C. Farmer иB.P. Garber, создав методику получения липосом. При осуществлении микрокапсулирования растворов гемоглобина для создания искусственных мембраниспользуются, кроме липидов, и синтетические полимеры, некоторыеполимеризованные белки. Толщина получаемых мембран сравнима с толщиной мембран эритроцитов.
Основная проблема -короткий период циркуляции микрокапсул в кровеносном русле. А в 1989 г. Е.Tsuchida с помощью новейших методов создал структурные единицы в виде телецовальной формы диаметром в среднем 0,1 мкм. Каждая частица состояла из 500 -2300 гемов гемоглобина, заключенных в двухслойную фосфолипидную мембрану. Двухслойная мембрана липосом обладала повышенной механической прочностью истабильностью. Последняя значительно увеличивалась при внедрении особымспособом в состав мембран токоферола (витамина Е), являющимся сильнымантиоксидантом. Он предохранял мембрану от разрушительного действия оксидантов и удлинял срок сохранения ее структурной целостности. Призамещении крови на 80 - 90% все животные выживали. Из этого следует, что посути дела речь идет о создании аналогов функционирующей клетки.
Казалось бы, что этаупрощенная модель эритроцита, судя по экспериментальным данным, может успешнофункционировать в человеческом организме, и пора бы переходить на клиническиеиспытания. Но в этих липосомах гемолипидный комплекс был способеносуществить лишь около 1 тысячи циклов "оксигенация - дезоксигенация".Это означает 6 - 8 часов "работы". Эритроцитарный же гемоглобин функционирует в течение 90 - 120 дней (по другим данным 40 дней) и способеносуществить 400 тысяч циклов.
Кроме этого, автор всвоей работе засекретил методику изготовления микротелец, но, учитываястроение микротелец и насколько сложна их конструкция, можно предположить, что методика очень дорогая и трудоемкая, и она не сможет удовлетворить потребности, например при массовом травматизме. К тому же возникает вопрос омеханизмах разрушения и дезактивации таких очень сложных структур и продуктових разрушения. Отмечается также внедрение искусственных липосом в элементыретикулоэндотелиальной системы клетки и нарушении ее функции [3, 6, 22].
Самой важной проблемой создания "искусственной крови" данного направления остается сохранение гемоглобином нативных свойств в течении длительного промежуткавремени. В норме непрерывно происходящее разрушение этой сложной молекулы вэритроците купируется с помощью биологической работы ресинтеза, котораяпротекает с использованием энергии за счет гидролиза АТФ. Возможностьискусственного получения таких мембран была показано еще 20 лет назад. Имеетсяпринципиальная возможность создания таких мембран и для гемоглобинсодержащихлипосом, но такая перспектива выглядит довольно отдаленной [6, 12].
Очень перспективным идовольно интересным является другой вариант конструкции кислородпереносящих кровезаменителей на основе гемоглобина является разработка конъюгированного (или модифицированного) гемоглобина. Обычно это соединение гемоглобина снекоторыми органическими молекулами, которые защищают гемоглобин от разногорода внешних воздействий.
В качестве защитноговещества можно использовать полиоксиэтилен. В опыте было показано, что призамещении крови этим раствором у собак до 5 % каких-либо функциональных иорганических изменений обнаружено не было. Полупериод жизни препарата составил36 часов. Но снова возникает вопрос, на который в литературе нет ответа: акаковы механизмы разрушения такой сложной системы. Но и еще полупериод жизни 36 часов предполагает во времени повторную трансфузию, а последствияповторных массивных инфузий неизвестны, а поэтому непредсказуемы [6, 8]. Хотя известно, что в растворе полимеризованных гемоглобинов есть вызывающиетоксичность примеси - стромальные липиды, эндотоксины, высокомолекулярныефракции гемоглобина, а через почки выводится лишь только половинагемопротеида, вторая половина из плазмы исчезает, но не появляется в моче, т.е. захватывается организмом. Большую роль в это играет процессытрансгемирования гемоглобина ( переход гема с гемоглобина на человеческийсывороточный альбумин). Поэтому эти препараты с осторожностью назначают при печеночной недостаточности в связи с нарушением белковообразовательной функциипечени [15].
Недостатокмодифицированного гемоглобина - в более высоком, по сравнению с донорскойкровью, сродстве к кислороду, что связано с отсутствием регулятора обратнойоксигенации и более низкой кислородной емкости. В последнее время найденметод, который позволяет устранить этот недостаток путем создания модифицированного гемоглобина, способного к обратимой оксигенации. Регуляторомв таком случае является имизатглутаралальдегида: в атмосфере азота к глобинуприсоединяется пиридоксаль-фосфат, в дальнейшем полимеризация полученныхкомплексов посредством сшивания глутаралальдегидом. В качестве основы длятакого полимеризованного гемоглобина можно использовать даже гемоглобинкрупного рогатого скота. Но при всех этих преимуществах наблюдаются выраженныеиммунные реакции организма на введение такого препарата, полученного из гемоглобина животных. Кроме того, применяется еще и внутримолекулярная сшивкадля увеличения времени циркуляции препарата в кровеносном русле, но при этомнужно учитывать доказанную экспериментально малую селективность его,приводящую к образованию производных гемоглобина [3].
Вследствие большихразмеров молекулы модифицированного гемоглобина (при его степени полимеризациисвыше 25 - 30%) увеличивается СОЭ до 55 - 60мм/ч [1].
В последнее время активизировались исследования бычьего гемоглобина с целью использования его в качестве основы для создания "искусственной крови". Бычийгемоглобин тщательно очищают от примесей путем кристаллизации, полимеризуют исоединяют его с пиридоксаль-фосфатом.
Благодаря слабым антигенным свойствам бычий гемоглобин в принципе может быть использован дляконструирования "искусственной крови". Но нельзя не учестьвозможность анафилактических реакций, при повторной инфузии их вероятностьувеличивается во много раз [6]. Бычий гемоглобин имеет преимущество надчеловеческим своей высокой доступностью и низкой стоимостью; отсутствием рисказаражения реципиента инфекционным гепатитом и СПИДом; кроме этого, в силу своихструктурных особенностей имеет низкое сродство к кислороду, близкое к таковомудля донорской крови человека. Это позволяет избежать при получении полимера избычьего гемоглобина по сравнению из гемоглобина человека весьма трудоемкогоэтапа - присоединения регулятора обратимой оксигенации пиридоксаль-5'- фосфата[16].