Под действием химических веществ различных концентраций могут изменяться морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов. Например, в присутствии сублетальных концентраций катионов тяжелых металлов изменяются почти все перечисленные свойства микробных клеток, их форма, размеры, ослабляются ростовые процессы, понижается ферментативная активность, интенсивность дыхания (Сенцова и др.,1985). Под действием Ni2+ на морскую бактерию Artrobacter тariпиs значительно увеличиваются размеры клеток: при концентрации Ni2+4*10-4 моль объем их за 4.5 ч возрастает в 250 раз (Gobetetal., 1970). В процессе роста бактерий и дрожжей на среде, содержащей медь, размеры клеток уменьшаются (Авакян, 1973). В присутствии комплексных ионов платины клетки Е. coliприобретают нитевидную форму (Rosenbergetal.,1967).
Многие токсические вещества вызывают появление у бактерий слизистой капсулы, предохраняющей клетку от гибели. Под действием фенола, этилового спирта утрачивается подвижность клеток бактерий рода Proteus (Нестерова, 1972). Регистрируют морфологические изменения путем микроскопирования препаратов живых или фиксированных клеток с помощью электронного микроскопа. Предложено также дополнительное устройство, содержащее ряд камер и позволяющее наблюдать за развитием микроорганизмов в проточных питательных средах высокоапертурными объективами микроскопов (Гашинский, 1973).
Способы регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов многообразны. Они включают визуальные, приборные и математические методы. На визуальной оценке результатов основаны полуколичественные методы определения антибиотиков (Сиволодский, 1974), латекса трибутилоловосодержащего сополимера АБП-10П, метода оценки токсичности сточных вод. Полуколичественный метод определения оловоорганического соединения АБП-10П разработан учеными (Туманов и др., 1998) на основе регистрации ростовых реакций трех различных по чувствительности штаммов бактерий B. laterosporus, B. pumilis 732 и Sarcinalutea(Туманов и др., 1988). Он позволяет определять нерастворимые в воде соединения (без предварительного их разложения) в диапазоне концентраций 2-40 мкг/мл. Метод оценки токсичности сточных вод (Павленко и др., 1988) с использованием условно прототрофного штамма Saccharomycescerevisiae дает возможность количественно характеризовать токсико-генетическое действие промышленных сточных вод путем регистрации цитостатического и летального эффектов.
При качественном обнаружении и количественном определении биологически активных веществ часто принимают во внимание зависимость культуральных свойств микроорганизмов от химического состава среды. К ним относятся различные ростовые реакции: стимуляция или ингибирование роста в зависимости от концентрации определяемого вещества и связанные с ними изменения численности клеток, продолжительности отдельных фаз роста, динамики накопления биомассы, размеров бактериальных колоний, характера их поверхности и пигментации (Рубенчик, 1972; Глухова, 1980).
Наиболее простым и широко распространённым способом регистрации ростовых реакций микробных культур является измерение диаметра и площади зон угнетения или стимуляции роста бактерий при выращивании их на плотных средах. Этот принцип положен в основу методов определения многих антибиотиков и витаминов (Егоров, 1965). Он реализован при разработке метода определения трилана (4,5,6-трихлорбензоксизалинона-2), используемого для защиты бумаги и изделий из нее от биоповреждений (Туманов и др., 1982). В качестве аналитического сигнала использована ростовая реакция бактерий Bacillusmesentericus 5 Trevisan, характеризующихся повышенной чувствительностью к трилану и устойчивостью в щелочной среде. Диаметр зоны угнетения роста тест-культуры в растворе 0,1 М КОН пропорционален логарифму концентрации указанного соединения. Предложенный способ позволяет определить трилан в диапазоне концентраций от 5 до 100 мкг в 0,1 мл раствора, а также в бумаге.
Для определения этилмеркурхлорида в качестве аналитических индикаторов использовали культуры гриба Aspergillusniger и дрожжей Torulacandida, регистрировали их ростовую реакцию измерением площади зон подавления роста. Предел обнаружения – 0,1 мкг/мл, относительная погрешность метода – 10% (Туманов и др.,1982).
Изменения численности микробных клеток под действием биологически активных веществ часто фиксируют с помощью турбидиметрических методов, измеряя оптическую плотность жидкой культурной среды, в которой выращивают микроорганизмы, с помощью фотоэлектроколориметра или нефелометра.
Метод определения загрязнённости вод, описанный в (Потапова и др., 1988), основан на ингибировании роста культур водных бактерий и позволяет оценивать качество сточных вод, содержащих сернокислую медь в концентрации 1×10-3 мг/л и более, смесь пестицидов пропанида и сатурна в концентрациях 5×10-5 и 1×10-3 мг/л, смесь фенола и формальдегида в концентрациях 5×10-2 и 1×10-2 мг/л, соответственно.
Одним из культурных свойств бактерий является способность к образованию пигментов, которая утрачивается при отсутствии в среде некоторых элементов. На этом основан визуальный способ качественного обнаружения катионов железа, меди, магния и некоторых других элементов (Месробяну и др., 1963).
Отклик микроорганизмов на изменение химического состава среды выражается не только в интенсивности процессов воспроизводства (размножения) или ростовых реакциях, но и в разнообразных физиолого-биохимических реакциях.
В качестве аналитического сигнала могут быть использованы термограммы микроорганизмов. В работе (Monk, 1978) приведены доказательства зависимости количества тепла, выделенного микробными клетками, от химического состава среды.
Объективным показателем содержания в среде токсичных примесей могут служить активность данного микроорганизма, которая изменяется в зависимости от концентрации отдельных веществ.
В последние годы для аналитических целей стали использовать люминесцентные свойства светящихся бактерий, принадлежащих к роду Photobacterium и Beneckea. Биолюминесцентный анализ основан на специфических реакциях с высоким квантовым выходом, позволяющих применять их для определения многих биологических активных веществ.
Показана возможность использования светящихся бактерий для определения фенольных компонентов сточных вод (Данилов и др.,1988). В качестве токсинов использовали типичные представители фенолов сточных вод: монофенолы, резорцин, гидрохинон и продукты его окисления н-бензохинон.
Биологический метод анализа может основываться не только на подавлении жизнедеятельности живых организмов. Перспективным приёмам повышения чувствительности этого метода является использование биологического концентрирования. Процесс биологического концентрирования использовали для выделения малых концентраций жизненно-необходимых катионов из разбавленных растворов (Постнов и др., 2000). В качестве аналитического индикатора применён плесневый гриб Aspergillusniger, выращенный на питательном растворе, содержащем определённые количества катионов железа, меди или цинка. Показателем содержания катионов в растворе служила биомасса гриба и данные последующего спектрального определения их в биомассе после высушивания и минерализации. Установлены уровни концентраций катионов, подавляющих рост культуры гриба; они в десятки раз превышают концентрации, стимулирующие её рост. Таким образом, включение в аналитический арсенал методик, основанных на стимуляции роста индикаторных организмов, расширяет границы традиционного биотестирования, значительно повышает чувствительность биологического метода анализа.
Обобщая приведенные данные, касающиеся особенностей микробиологических методов определения токсических веществ, следует отметить многообразие ответных реакций микробных культур на воздействие химических элементов и соединений и разнообразие способов их трансформации в аналитический сигнал. Выбор наиболее эффективных из них зависит от механизма и глубины воздействия вещества на индикаторный организм, что, в свою очередь, определяет чувствительность и избирательность биометода (Туманов, 1998).
В зависимости от целей анализа возможны как визуальные, так и инструментальные способы оценки и регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов. При контроле химических загрязнений водной среды и анализе их состава предполагается использование специальной аппаратуры типа ферментеров-хемостатов, турбидостатов. В них автоматически поддерживается режим культивирования по основным параметрам среды (растворенный кислород, температура, рН среды, плотность микробной культуры) (Mitrukaetal., 1975; Крайнюкова, 1988). Чувствительные и надежные токсикогpафы для регистрации аналитического сигнала позволяют избежать субъективных ошибок и повысить воспроизводимость результатов.
Перспективны в развитии микробиологических методов биоаналитические устройства – биосенсоры, содержащие иммобилизованные клетки микроорганизмов и обеспечивающие контакт определяемым веществом. Их составной часть являются преобразователи биохимической или ростовой реакции микробного индикатора в аналитический сигнал. В этом случае биологический объект выступает в роли первичного источника информации, которая затем воспринимается находящимся в непосредственной близости вторичным – физическим датчиком.
Современные способы быстрого контроля токсических загрязнений природных и сточных вод предусматривают введение биометрической или другой биоэлектрической информации в ЭВМ, пригодной в качестве элемента мониторинга биосферы (Туманов, 1998).