Правильный выбор сорбента и растворителя (смеси растворителей) определяет эффективность (полноту) разделения. Выбор хроматографической системы определяется природой анализируемой смеси. Например, насыщенные углеводороды сорбируются в очень малой степени и поэтому движутся в нем с более высокой скоростью. Ненасыщенные углеводороды сорбируются тем сильнее, чем больше в них содержится двойных связей. Для их разделения следует использовать наиболее активные сорбенты и малополярные растворители. Для органических веществ, содержащих разные функциональные группы, адсорбционное сродство повышается в следующем ряду: -СН3 , -О-аlk, >С=О, -NH2 , -ОН, -СООН. Это приводит к тому, что на слоях силикагеля или окиси алюминия при применении в качестве растворителя, например бензола, простые или сложные эфиры располагаются в верхней части хроматограммы, кетоны и альдегиды - примерно в середине, спирты - ближе к линии старта, а кислоты остаются на старте.
Растворители разной природы, используемые в ТСХ, различаются по их элюирующему (вытеснительному) действию, и их можно расположить в так называемые элюотропные ряды. Наблюдается очевидная зависимость между полярностью и элюирующим действием растворителя. Например, элюотропный ряд для силикагеля по мере возрастания элюирующей способности выглядит следующим образом: н-гексан, пентан, циклогексан, четыреххлористый углерод, толуол, хлороформ, дихлорметан, диэтиловый эфир, уксусная кислота, этанол, метанол, пиридин, вода.
Методы обработки хроматограмм. Для получения информации о качественном и количественном составе анализируемой смеси используют различные методы детектирования - как химические, так и физические. В последние годы значительно возросло использование ферментативных методов, особенно в клинической диагностике, при определении пестицидов. Пластинки ТСХ выполняют роль дискет, с которых химическая, физическая или ферментативная информация может быть считана в любом месте и в любое время. Все это в отличие от других вариантов хроматографии происходит отдельно от процесса разделения, и этим устраняется влияние подвижной фазы. Отсюда следует, что селективность (избирательность) метода ТСХ складывается из селективности процесса разделения и специфичности детектирования, взятых вместе.Это преимущество присуще только ТСХ.
Идентификацию веществ (качественный анализ) можно проводить по равенству значений Rf анализируемого вещества и стандарта ("свидетеля"). Если на хроматограмме образуются окрашенные зоны, то это значительно упрощает ее обработку. Невидимые хроматограммы проявляют (находят зоны разделенных веществ) химическими и физическими способами.
При химическом способе пленку или бумагу опрыскивают раствором или держат в парах взаимодействующего с компонентами анализируемой смеси реагента. Эти реактивы разделяют на два типа: 1) реактивы общего назначения, позволяющие обнаружить большое число соединений различных классов; 2) более специфичные реактивы, позволяющие обнаружить соединения определенного класса или с определенной функциональной группой. К реагентам общего назначения относятся концентрированная серная кислота, раствор бихромата калия в концентрированной серной кислоте, 1%-ный спиртовый раствор иода, фосфорно-молибденовая кислота, родамин. Одно из существенных преимуществ ТСХ по сравнению с бумажной хроматографией - возможность использования агрессивных проявителей.
Примером селективного реагента, позволяющего визуально по окраске пятен обнаруживать присутствие аминосоединений различной природы в смесях, является 4-хлор-5,7-динитробензофуразан. При физическом способе проявления зон пластинку облучают УФ-лучами. Сорбент обычно содержит флуоресцентные индикаторы (силикаты цинка, сульфиды цинка или кадмия, вольфраматы щелочноземельных металлов), и пластина при облучении светится бледно-голубым светом. Если на пластинке есть вещества, способные поглощать УФ-излучение (ароматические и содержащие сопряженные С=С-связи вещества), то происходит ингибирование флуоресценции. Поэтому на ярком фоне пластинок появляются темные зоны, соответствующие определяемому соединению.
Более информативная идентификация веществ достигается при использовании спектральных методов детектирования (спектрофотометрия, флуориметрия, ИК-спектроскопия). Совпадения спектральных характеристик анализируемых и эталонных веществ является подтверждением их идентичности. Реакции ингибирования ферментативных реакций на хроматографической пластинке также используются для идентификации веществ.
Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (на слое сорбента или бумаге). Часто анализируемое вещество вымывают из слоя сорбента и полученный раствор анализируют каким-либо методом. В обоих случаях используют перечисленные выше спектральные, а также радиометрические методы. Предпочтение отдается первому способу, так как при этом значительно повышаются экспрессность и чувствительность определения. Следует отметить, что чувствительность определения зависит не только от условий разделения. Например, чем меньше Rf анализируемого вещества, тем менее размыта зона. Для рутинных количественных определений в ТСХ широко используют денситометры, которые измеряют интенсивность поглощения электромагнитного излучения при сканировании хроматографической пластинки. В результате регистрируется хроматограмма, которая имеет форму, аналогичную для газовой и других видов жидкостной хроматографии [3].
Во многих случаях для определения содержания веществ после разделения на пластинках ТСХ используют полуколичественный метод, применимый и в школьной лаборатории. Он заключается в визуальном сравнении размера пятна (а также сопоставлении их интенсивностей) с размерами серии пятен этого же вещества с известными концентрациями (стандартные растворы). Несмотря на простоту подхода, он обеспечивает правильность определения 5-10% при содержании 1-5 мкг.
Современное состояние и перспективы планарной хроматографии. Как это часто бывает в истории развития любого инструментального метода, после бурного развития в 60-70-х годах планарную хроматографию потеснил новый метод - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Однако в последние годы тонкослойный вариант планарной хроматографии получил новый импульс для развития и наблюдается возрастание его роли в хроматографических методах. Это связано с меньшей стоимостью оборудования для ТСХ, разработкой двумерного и радиального вариантов разделения, внедрением пластин для высокоэффективной хроматографии, появлением систем автоматизированного многократного хроматографического проявления (АМХП). В двумерной хроматографии анализируемую смесь элюируют одним растворителем (или смесью), затем пластинку сушат и под углом 90° элюируют вторым растворителем. В радиальной хроматографии растворитель с регулируемой скоростью подается в центр пластинки, заставляя зоны перемещаться от центра к периферии. Это позволяет существенно ускорить процесс разделения.
Особенно перспективной является методика АМХП. Она удобна для определения пестицидов и продуктов их метаболизма в почвах, грязевых шламах и почвенных водах, а также в питьевой воде и водах минеральных источников. Хроматографическое разделение проводят в АМХП-системе, работа которой управляется и контролируется при помощи компьютера. Проводят многократное хроматографическое проявление (прогон растворителя). При таких многоступенчатых проявлениях (до 25 шагов) с возрастающей длиной полосы разделения и градиентным ступенчатым уменьшением полярности растворителя возможно разделение до 40 веществ на разделительной полосе длиной 8 см.
Важное значение имеет развитие высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). За счет создания принудительного движения подвижной фазы с регулируемой скоростью, уменьшения размера частиц сорбента (до 5-7 мкм) и насыщения пространства над пластиной парами растворителя удается существенно ускорить процесс и повысить четкость разделения.
Широко используется сочетание ТСХ с другими методами, в частности с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Например, такой прием применяют при анализе сточных вод. Первоначально анализируемый образец можно разделить на колонках ВЭЖХ. После этого отдельные фракции наносят на пластинки ТСХ и проводят разделение с использованием методики АМХП. Таким образом в анализируемой смеси разделяется до 30 отдельных фракций. В каждой из этих фракций, в свою очередь, на пластинке ТСХ определяется до десяти соединений. В отдельных случаях в образцах таким образом обнаруживали присутствие до 300 веществ. Такой прием продемонстрировал эффективность совместного использования двух методов при определении веществ в диапазоне концентраций от нанограммов до пикограммов.
Применение планарной хроматографии в анализе сложных смесей органических соединений. Возможности тонкослойной хроматографии в анализе различных объектов можно проиллюстрировать на примере анализа полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), гербицидов на основе фенилмочевины и стеролов в пищевых продуктах.
Хорошо известно, что некоторые ПАУ обладают канцерогенной активностью. Их анализ актуален с экологической точки зрения: они присутствуют в следовых количествах в минеральном масле, воздухе, воде, выхлопных газах, а также в пищевых продуктах. Нормы по питьевой воде устанавливают их граничную концентрацию в 0,2 мкг/л для шести ПАУ, одним из которых является бензо(а)пирен