Каждый феромон (гекса- или октопептид) индуцирует слипание (clumping) бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определённой плазмиды. Например, октапептид cPD1 стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPD1. Плазмида кодирует феромонный рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Так, плазмидa pPD1 несёт ген traA с указанной функцией [86]. Феромон взаимодействует с рецептором и выводит из строя репрессор, запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPD1 включает также ген traC, чей продукт представляет собой феромон-связывающий белок, облегчающий проникновение пептида-феромона через клеточную стенку (эффективность феромона в сферопластах не зависит от экспрессии гена traC [82]). Феромоны интенсивно синтезируют только клетки, не несущие соответствующих плазмид. У клеток-доноров подавлен синтез феромона; более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид. Продуктом плазмиды pPD1, например, является пептид iPD1, инактивирующий феромон cPD1 [69, 86].
У Bacillus subtilis споруляция эффективно происходит при высокой плотности клеточной популяции или при добавлении культуральной жидкости от подобной популяции. Процесс регулируется плотностно-зависимой системой с олигопептидным сигнальным агентом, кодируемым геном pfrA в форме неактивного предшественника (пептида, состоящего из 41 аминокислоты). При экскреции из клетки у этого пептида, как у многих других сигнальных пептидов, отщепляется N-концевая последовательность. Остающийся пептид (19 аминокислот) в свою очередь подвергается воздействию внеклеточной пептидазы, в результате чего получается активный сигнальный пентапептид (РЕР5) [87].
Выяснен механизм активации споруляции у B. subtilis посредством РЕР5. Он поглощается внутрь клетки с помощью пермеазы олигопептидов и при достаточной концентрации ингибирует фосфатазу RapA, образуя с ней неактивный комплекс. В отсутствии активной фосфатазы ключевые факторы споруляции Spo0F и Spo0A поддерживаются в рабочем – фосфорилированном – состоянии. Интересно, что ген фосфатазы rapA ко-транскрибируется вместе с геном pfrA – они образуют единый оперон. При низкой клеточной плотности образуемый после экскреции и процессинга PfrA пептид РЕР5 поступает в клетку в низкой (подпороговой) концентрации, и тогда Spo0F и Spo0A дефосфорилируются посредством RapA – споруляции не происходит. Достижение кворума означает формирование комплекса PfrA:PEP5 и, соответственно, запуск программы споруляции [72, 86].
Высказаны сомнения, в том что пептид РЕР5 действительно служит феромоном в плотностно-зависимой системе, поскольку в культуральную жидкость попадают очень незначительные количества данного пептида. Не застревает ли он в клеточной стенке и не играет ли в этом случае цикл экскреции предшественника, его процессинга и обратного поглощения активного пептида просто роль своебразного таймера для процесса споруляции? [87]. По нашему мнению, низкая концентрация пептида в супернатанте культуры может означать его преимущественную локализацию во внеклеточном матриксе. Распространение химического агента по матриксу вполне совместимо с его феромонной ролью в масштабе бактериальной популяции.
Установлено, что плотностно-зависимые системы с пептидными феромонами регулируют компетентность к генетической трансформации у B. subtilis и Streptococcus pneumoniae (где активируется трансформация генов устойчивости к антибиотикам от других видов Streptococcus, вызывающих оральные инфекции), а также вирулентность Staphylococcus aureus [72, 88]. Интересно, что как и системы типа luxI-luxR, пептидные плотностно-зависимые системы регуляции во многих случаях функционируют у симбиотических/паразитических микроорганизмов.
Более того, макроорганизм также использует пептидные сигнальные агенты, выступающие в роли внутриорганизменных регуляторов. Например, в ответ на внедрение бактерий рода Rhizobium растение-хозяин (горох, соя и др.) образует пептид (около 10 аминокислот), который модифицирует эффект гормона ауксина на растительные клетки. А именно, изменяется концентрационная зависимость стимуляции ауксином клеточных делений. В норме (без этого пептида) максимальная ситмуляция наблюдается при ~5 мкМ ауксина, и эффект ослабляется при повышении концентрации ауксина. Однако в присутствии пептидного регулятора кривая концентрационной зависимости имеет плато вплоть до ~20 мкМ [89]. Белковый феромон в плотностно-зависимой системе у одноклеточной эукариоты – водоросли Volvox carteri – стимулирует рост этого микроорганизма уже в концентрации около 10-16М [14].
По-видимому, широко распространённым явлением у микроорганизмов является аутоиндукция роста, позволяющая преодолеть состояние глубокого покоя (dormancy) [9, 14, 16]. Так, культура Micrococcus luteus, голодавшая в течение 3-6 месяцев, претерпевает лишь немного клеточных делений после пересева на богатую среду; далее следует остановка роста. Однако, добавление 20-30% супернатанта другой культуры, доросшей до ранней стационарной фазы на богатой среде, предотвращает остановку роста голодавшей популяции M. luteus и обеспечивает ее нормальный рост [14, 22].
3. Кворум-зависимые системы с феромонами аминной (аминокислотной) природы. У миксобактерийMyxococcus xanthus, наряду с недиффундирующим фактором С (см. выше), имеется диффузный фактор А, ответственный за кворум-зависимуюинициациюагрегации клеток с последующим формированием плодовых тел [90] (агрегация не происходит при плотности клеток не менее 3.108 в мл). Фактор А является смесью аминокислот [72, 90] и представляет собой продукт действия внеклеточных протеаз на поверхностные белки клеток [90]. Комбинация фактора А и дефицита питательных веществ активирует двухкомпонентную систему генов sasS—sasR, инициирующую агрегацию клеток и формирование плодовых тел [72]. Интересно, что входящие в состав фактора А кетогенные аминокислоты в дальнейшем утилизируются клетками через глиоксилатный шунт [72].
Рассмотренные выше плотностно-зависимые системы типа luxI-luxR фактически относятся к системам, базирующимся на производных аминокислоты, а именно гомосерина. Гомосерин не входит в состав белков. но служит универсальным для всех живых организмов интермедиатом в синтезе некоторых аминокислот. Мы рассмотрели ацилированные лактоны гомосерина отдельно только потому, что эта система коммуникации является классической.
Макро- и микроструктура колоний E. coli формируется под влиянием образуемых ее клетками градиентов атрактанта - аспарагиновой кислоты [91]. Сложные орнаменты (концентрические круги, гексагональные решетки и др.) формируются при наложении двух градиентов феромона - 1)исходящего от центра колонии и 2) образуемого клетками на её периферии. Аспарагиновая кислота в то же время представляет собой эволюционно-консервативный сигнальный агент, втом числе один из нейротрансмиттеров (веществ, передающих возбуждение от нейрона к нейрону) у млекопитающих.
В этой связи интересно, что другие нейротрансмиттеры, а именно биогенные амины, также эволюционно-консервативные сигнальные молекулы, содержатся у микроорганизмов и, будучи добавленными к их культурам, оказывают ростовые и структурные эффекты на микробные колонии [18, 19, 92-95]. Так, серотонин (5-гидрокситриптамин), нейротрансмиттер и гистогормон у высших организмов, в то же время представляет интерес как возможный агент микробный коммуникации. Это предположение базируется на данных о стимуляции агрегации клеток E. coli, Rhodospirillum rubrum и миксобактерий рода Polyspondilum добавленным серотонином [18]. В тех же концентрациях (10-7—10-5 М) серотонин стимулирует рост микроорганизмов [18, 95].
Другой нейротрансмиттер и гормон—норадреналин, также ускоряет рост патогенных энтеробактерий. У патогенных штаммов он стимулирует синтез адгезина К99 и Шига-подобных токсинов I и II [92]. Примечательно, что норадреналин не стимулирует рост непатогенных штаммов E. coli (неопубликованные данные авторов этой статьи). Всё это подкрепляет предположение Лайта [92] об адаптивном характере ноадреналин-зависимой стимуляции роста бактерий. Патогенные энтеробактерии используют защитную реакцию организма (интенсивный синтез норадреналина в ответ на стресс,вызванный инфекцией) ради собственного блага. Микроорганизмы содержат многие другие нейротрансмиттеры и гормоны (гистогормоны) высших животных (γ-аминомасляная кислота, β-аланин, инсулин и др.) [92, 93], которые участвуют как во взаимодействиях между симбиотической/паразитической микробиотой и макроорганизмом, так, по-видимому, и в межклеточной коммуникации у микроорганизмов (подробнее см. наш обзор. [19]).
Исследование роли эволюционно-консервативных аминов и аминокислот в межклеточной коммуникации микроорганизмов и во взаимодействии микробиоты и животного организма – тема научной работы, проводимой коллективом автором в настоящее время. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электродетекцией нами обнаружен серотонин у Bacillus cereus и Staphylococcus aureus [96] (ранее он детектирован Страховской с соавт. у Enterococcus faecalis [95]), нораденалин у всех исследованных бацилл, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, дрожжей, грибка Penicillum chrysogenum, а дофамин – у широкого круга исследованных прокариот [96].
Представляет интерес также наличие у микроорганизмов белков, гомологичных рецепторам нейромедиаторов. Так, пурпурная фототрофная бактерия Rhodobacter sphaeroides содержит гомолог бензадипинового рецептора — одного из типов рецепторов к тормозному нейромедиатору γ-аминомасляной кислоте [97]. Известно, что митохондрии эукариотических клеток – симбиотические потомки прокариот, а именно, той их подгруппы, в состав которой входит и R. sphaeroides. Поэтому исследования бактериальных рецепторов к нейромедиаторам и в целом эффектов эволюционно-консервативных нейромедиаторов в микробных системах весьма актуальны для нейрохимии мозга в связи с данными о роли митохондрий мозговых нейронов в связывании нейромедиаторов. Mитохондрии нейронов содержат рецепторы к глутамату (NMDA-подтипа) [98]. Если глутамат присутствует в высоких концентрациях, его связывание с этими митохондриальными рецепторами ведёт к массивному поступлению ионов Са 2+ внутрь митохондрий, диссипации мембранного потенциала, снижению внутриклеточной концентрации АТФ и в конечном счёте к апоптозу (см. выше). Апоптоз нейронов мозга в связи с избыточными концентрациями глутамата и других нейромедиаторов, вероятно, происходит при таких нейродегенеративных заболеваниях, как ишемический инсульт, болезни Паркинсона, Альцгкймера и Хантингтона [98].