Снижение образования антибиотика наблюдается и у вариантов с усиленной стимуляцией.
Образующиеся в результате изменчивости Act. streptomycini варианты могут отличаться от исходной культуры окраской воздушного мицелия; последний может быть белым, беловато-палевым, светло-серым, серым и серо-зеленым. Различные варианты отмечаются друг от друга по величине и форме колоний. Встречаются так же формы, неспособные образовывать стрептомицин. Однако установить какие-либо цитологические различия между активными и неактивными вариантами не удалось.
б) Антибиотические свойства стрептомицина.
По отношению к стрептомицину все микроорганизмы условно можно разделить на три группы (Шемякин, Хохлов и др., 1961).
1. Весьма чувствительные микроорганизмы, которые подавляются в большинстве случаев при концентрации стрептомицина 10 мкг/мл. союда можно отнести организмы, принадлежащие к следующим родам: Bacillus, Bordetella, Brucella, Klebsiella, Mycobacterium, Bacteroidum и некоторые другие.
2. Умеренно чувствиетльные. Для подавления которых in vitro необходимо иметь концентрацию стрептомицина в пределах 10 - 100 мкг/мл. К этой группе относятся многие бактерии из родов Aerobacter, Corynebacterium, Diplococcus, Proteus, Staphylococcus, Strepticoccus, Vibrio.
3. Устойчивые формы микробов, для подавления которых необходима концентрация антибиотика, превышающая 100 мкг/мл. сюда относятся виды Bacteroides, Clostridium, некоторые виды Proteus, многие виды грибов, дрожжей, риккетсий, вирусы.
Итак, различные организмы по-разному реагируют на присутствие в среде стрептомицина. Степень антимикробного действия антибиотика также различна в отношении различных видов организмов (таблица 11).
Таблица 11.
Антибиотическая активность стрептомицина in vitro.
| Микроорганизм | Концентрация стрептомицина (мкг/мл), вызывающее подавление | ||
| Наиболее чувствительные штаммы | Наиболеее устойчивые штаммы | Большинство штаммов | |
| Aerobact. aerogenes Bac. anthracis Bac. megatherium Bac. subtilis Candida albicans Clostridium botulinum Corinebact. giphtheriae Diplococcus pneumniae E. coli Mycob. tuberculosis Proteus vulgaris Ps. aeroginosa Bact. thyphi Bact. dysenteriaeBac. cereus | 0,300 0,250 0.250 0.056 - - 0.400 0.500 0.015 0.100 1.000 0,100 0,004 2,000 0,830 | 1000 10 4 128 - - 200 50 >1000 12,5 >1000 1000 20 8 2 | 25 5 2 25 Устойчивы >> 20 25 25 5 15 50 5 5 1 |
Наряду с тем, что стрептомицин подавляет рост многих видов микроорганизмов, к нему довольно легко появляется устойчивость, возникают формы бактерий, резистентные к стрептомицину. По данным Прайса (Price et al., 1947), повышение устойчивости к стрептомицину в 1 000 раз возникает у золотистого стафилококка всего лишь через три пассажа на бульоне с возрастающими концентрациями антибиотика, а у Bact. typhi повышение устойчивости в 22 600 раз происходило через 14 пассажей.
Образование устойчивых форм бактерий к стрептомицину происходит также in vivo. Приобретенная к стрептомицину устойчивость сохраняется у организмов довольно длительное время. С возникновением устойчивости появляются некоторые изменения в характере обмена веществ. так, у резистентного к стрептомицину хромогенного микроорганизма происходит резкое изменение его окраски. Стрептомициноустойчивая форма синегнойной палочки теряет способность образовывать пигмент, изменяются и некоторые другие стороны обмена.
Однако у устойчивых и чувствительных к стрептомицину штаммов бактерий не наблюдается заметных различий в вирулентности.
В ряде случаев под действием стрептомицина в опытах in vitro возникают не только устойчивые к нему штаммы, но и зависимые от стрептомицина формы, способные развиваться только в присутствии данного антибиотика.
Описаны случаи, когда штаммы менингококка, Mycob. ranae и другие микроорганизмы развиваются лишь на среде, содержащей от 100 до 150 мкг/мл стрептомицина.
Стрептомициноустойчивые и зависимые от стрептомицина штаммы обычно получаются из чувствительных форм микроорганизмов. Соотношение между чувствительными, устойчивыми и зависимыми от стрептомицина штаммами изображено на рисунке.
3. Поглощение антибиотиков клетками микробов.
Первый этап во взаимодействии микроорганизмов с антибиотиками - адсорбция его клетками. Пасынский и Косторская (1947) впервые установили, что одна клетка Staphylococcus aureus поглощает примерно 1 000 молекул пенициллина. В последующих исследованиях эти расчеты были подтверждены. Так, по данным Мааса и Джонсона (1949), приблизительно 2·10-9 М пенициллина поглощается 1 мл стафилококков, причем около 750 молекул этого антибиотика необратимо связываются одной клеткой микроорганизма без видимого эффекта на ее рост.
Игл с сотрудниками (1955) определил, что при связывании бактериальной клеткой 1 200 молекул пенициллина угнетения роста бактерий не наблюдается. Угнетение роста микроорганизма на 90 % наблюдается в тех случаях, когда клеткой будет связано от 1 500 до 1 700 молекул пенициллина, а при поглощении до 2 400 молекул на клетку происходит быстрая гибель культуры.
Установлено, что процесс адсорбции пенициллина не зависит от концентрации антибиотика в среде. При низких концентрациях препарата (порядка 0,03 мкг/мл) он может весь адсорбироваться клетками, и дальнейшее повышение концентрации вещества не поведет к повышению количества связанного антибиотика.
Имеются данные (Купер, 1954) о том, что фенол препятствует поглощению пенициллина клетками бактерий, однако он не обладает способностью освобождать клетки от антибиотика.
Пенициллин, стрептомицин, грамицидин С, эритрин и другие антибиотики связываются различными бактериями в заметных количествах. Причем антибиотики-полипептиды адсорбируются микробными клетками в большей степени, чем, например, пенициллины и стрептомицин.
Булгакова и Полин (1966) установили, что грамицидин С адсорбируется как чувствительными, так и устойчивыми к нему бактериями. Причем адсорбция этого антибиотического вещества бактериями происходит сразу же после внесения антибиотика в суспензию клеток и достигает значительных величин (до 500 мкг/мг сухой биомассы).
В присутствии положительно заряженных ионов (Na+, K+, NH+, Mg2+), а также при рН среды, равном 4, поглощение грамицидина С бактериальными клетками заметно снижается.
Адсорбированный чувствительными клетками грамицидин С прочно связывается с бактериями и снимается с них лишь при длительной экстракции подкисленной спиртово-водной смесью.
У устойчивого к антибиотику штамма E. coli при промывании клеток раствором NaCl удается удалить лишь до 30% адсорбированного грамицидина С.
Ванкомицин, образуемый Actinomyces orientalis, необратимо и относительно быстро связывается клетками бактерий, чувствительными к нему. По данным Reunolds (1966), при концентрации антибиотика в среде, равной 30 мкг/мг массы сухих бактерий, около 90% ванкомицина связывается с бактериями. Показано, что максимальное связывание ванкомицина бактериальными клетками достигает величин 107 молекул антибиотика на клетку.
Связанные клеткой антибиотики могут проявлять двоякого рода действия: содной стороны, некоторые из них могут действовать как поверхностно-активные вещества, а с другой стороны, антибиотики, проникая вглубь клетки, нарушают отдельные стороны метаболизма организма.
Гибель клеток под воздействием поверхностно-активных антибиотиков может быть связана с нарушением механизма осмотического равновесия, имеющего место на поверхности микробной клетки; она может также наступить в результате способности этих веществ, скапливающихся у поверхности раздела жидкая фаза - микробная клетка, связываться с компонентами клеток.
Экспериментальные данные в этом отношении показали, что изменения в регулировании осмотического давления сопровождаются разрушением систем клеточной стенки микроба. Нарушение проницаемости клеточной стенки является или результатом прямого вливания антибиотических веществ, или же может быть результатом вторичных процессов.
Действие антибиотиков как поверхностно-активных веществ может вызывать диссоциацию белка с отделением от него простетических групп или нуклеиновых кислот. Эти вещества могут также приводить к денатурации белков и, таким образом, непосредственно влиять на энзиматические системы, связанные с клеточной стенки (инвертазы, фосфатазы, различные дегидрогеназы, цитохромные системы).
Таким образом, если антибиотик обладает способностью нарушать системы, регулирующие осмотические свойства клеточной стенки, иными словами, если антибиотик выступает в качестве поверхностно-активного соединения, то он может оказывать бактерицидное действие.
К числу антибиотических веществ, механизм действия которых связан с поверхностно-активными свойствами, следует отнести грамицидин С, тироцидин, полимиксины, а также тетрациклины, если последние применяются в концентрациях, во много раз превышающие бактериостатические.
Вместе с тем, как уже отмечалось выше, антибиотики, попадая в микробную клетку, могут нарушать отдельные этапы метаболизма организма, подавлять некоторые звенья в цепи биохимических процессов.
Подавление отдельных звеньев в биохимической цепи превращений может происходить как путем необратимого связывания антибиотиком одного из компонентов реакции, так и в результате конкурентного подавления биологически важных метаболитов клетки.