Московские власти не контролировали "польских" казаков, признавая тот факт, что "те разбойники живут на Дону без нашего ведома, а от нас бегают". Численность их росла. На Дон шли не только рязанские "заполяне", но и вольница из Северской земли и даже западнорусских земель. В донесении путивльского наместника Троекурова, направленном в 1546 г. в Москву, сообщалось о том, что "ныне казаков на Поле много, и черкасцов, и кыян, и твоих государевых – вышли, государь, на Поле из всех украин". К середине XVI в. казаки освоили донские и приднепровские степи и начали тревожить татар в их улусах. С нескрываемой тревогой о действиях донцов в 1551 г. писал ногайскому князю Исмаилу турецкий султан Сулейман I, по словам которого, "казаки с Озова оброк емлют и воды на Дону пить не дадут. А крымскому де царю потому ж обиды чинят великие". Перечисляя их, султан упоминает и не отраженный в русских источниках казачий набег на Перекоп.
Первый известный поход против Крыма донские казаки совершили в 1556 г. Войско во главе с атаманом М. Черкашенином, возглавлявшим казаков, живших на Северском Донце, на стругах по р. Миус спустилось в Азовское море, пересекло его и разорило окрестности Керчи. Двух захваченных во время похода "языков" казаки прислали в Москву.
Приток русского населения на Дон возрос в конце XVI в. в связи с усилением податного гнета в центральных областях Русского государства, разоренного Ливонской войной и опричниной. Среди уходивших на Дон людей было немало преступников, бежавших из Московского государства от заслуженного наказания. Им на руку был старинный обычай казаков не выдавать беглых русскому правительству. "И быв на Дону хотя одну неделю или месяц, - писал Котошихин, - а лучитца им с чем-нибудь приехать к Москве, и до них впред дела никакова ни в чем не бывает никому, что кто ни своровал, потому что Доном от всяких бед свобождаютца". Эта традиция оказалась живучей и сохранилась до времен Петра I.
Правительство, стремясь унять казачьи разбои и использовать их военный опыт для борьбы с татарской угрозой, стало привлекать вольных казаков к государственной пограничной службе. Как пограничная стража служилые казаки раньше всего появились на южных "украйнах", где существовала постоянная опасность вражеского нападения. Они сыграли очень важную роль при реорганизации в 1571 г. сторожевой и станичной службы, заменив отряды детей боярских, которые были возвращены в полковую службу.
До середины XVI в вольные казаки не включались в состав русского войска, однако их действия в южнорусских степях становились все более заметными. Игнорировать это обстоятельство московские власти не могли. Наличие общего врага сближало интересы Москвы с донским и запорожским казачеством.
Эпизодические контакты правительства с донскими казаками начались в конце 40 – начале 50-х годов XVI в., а в 70-е гг. приобрели постоянный характер. В немалой степени этому способствовало то, что по Дону шли все дипломатические и торговые сношения Русского государства с Крымом и Турцией. В то время донское казачество еще не имело единой войсковой организации, поэтому для обеспечения безопасности этого пути правительству приходилось контактировать с выборными властями отдельных юртов и отрядов, размещавшихся по берегам рек бассейна Дона.
Первое упоминание о "приборе" донских казаков на московскую службу относится к 1549 г. Направив к ногайцам посла И. Федулова, царь Иван IV предлагал им начать совместные действия против Крыма, сообщая, что уже "велел казакам своим путивльским и донским крымские улусы воевати и недружбу царю делати".
В том же 1549 г. несшие службу в степи "великого князя казакы Урачко с товарыщи" перехватили казанских послов, везших в Крым сообщение о смерти хана Сафа-Гирея. В 1550 г. донские казаки участвовали в боях с ногайцами под Рязанью. В конце 1550-х гг. они включались в состав русских войск, несших службу "на Поле". В источниках сохранилось упоминание о том, что из донских казаков состоял отряд головы Ю. Булгакова, в 1557 г. разбивший на р. Айдар татар, шедших в набег к русской границе ("под украйну"). Захваченных в бою "языков" привели в Москву казачьи атаманы Елка и Лопырь. Донские и волжские казаки участвовали в борьбе с ногайцами, в составе московских армий завоевывали Казань и Астрахань, бились на полях сражений Ливонской войны, несли службу в пограничных русских крепостях, получая за службу кормовое, а иногда и поместное жалованье.
Помимо дозорной и походной службы правительство прибегало к помощи казаков для охраны посольств и торговых караванов, обещая им жалованье, главным образом, сукнами, селитрой и свинцом, в которых казаки очень нуждались. Для успешного выполнения таких поручений атаманам разрешалось "прибирать" на "донскую службу" даже северских служилых людей, за которыми сохранялись их поместья.
Еще одним центром вольного казачества после завоевания Казани и Астрахани являлась Волга, куда донцы переходили с Дона и в поисках добычи спускались на своих судах в Каспийское море. Объектом их нападений становились торговые караваны и ногайские кочевья. В официальных бумагах того времени сохранились имена казачьих предводителей, разбойничавших на Волге: В. Мещерский и П. Путивлец. Первоначально правительство пыталось договориться с волжскими казаками миром. В 1557 г. на Волгу был направлен атаман Л. Филимонов, пользовавшийся полным доверием Москвы со времени покорения Астрахани. Он получил наказ предпринять меры, "чтоб казаки не воровали и на ногайские улусы не приходили". Казаки не послушались Филимонова и, убив атамана, напали на шедший вниз по Волге торговый караван и разграбили его. Расхищенной оказалась и государева казна, отправленная тогда в Астрахань. Это нападение стало первым зафиксированным в документах выступлением казаков против русского правительства. Оставить его без последствий московские власти не могли. На Волгу направили войска, включавшие дворянские сотни, стрельцов и отряды служилых казаков во главе с атаманами А. Ершовым, Б. Губиным и Д. Хохловым. Принятые правительством меры несколько разрядили обстановку. Английский посол Э. Дженкинсон, побывавший в этих краях вскоре после описанных событий отметил, что место у Переволоки ранее представляла опасность "из-за воров и разбойников; однако в настоящее время, вследствие завоеваний русского царя, оно не так страшно".
Однако полностью очистить Волгу от казаков не удалось и вскоре нападения возобновились. Об одном из них известно со слов англичан Т. Бэннистера и Джона Дэкета, корабль которых, направлявшийся из Ширвана в Астрахань, был атакован и захвачен казаками. Астраханский воевода выслал против разбойников 500 воинов на 40 лодках, а затем подкрепление еще на 60 лодках. В результате большого сражения разбойники были разбиты, многие из них погибли, другие бежали. В 1581 г. правительственные войска на Волге разгромили еще один казачий отряд. Возглавлявший его атаман Д. Бритоус был взят в плен и повешен.
Вынужденные покинуть Волгу, казаки вернулись на Дон, но часть их двинулись за Волгу. В конце июня - начале июля 1581 г. отряд атамана Нечая напал на ногайцев, разорив их столицу Сарайчик, располагавшуюся в низовьях реки Яик (Урал), положив тем самым начало яицкому казачеству. Окончательно казаки утвердились на Яике в 1586 г., поставив на Кош-Яицком острове напротив устья реки Илек постоянный городок. Ногайцы попытались уничтожить казачью крепость, долго осаждая ее, но, потерпев поражение, вынуждены были отступить. К концу XVI в. казачьи городки находились по всему Яику. С 1591 г. уральские казаки служили в рядах русского войска. Власть московского царя яицкие казаки признали при Михаиле Федоровиче, а до этого, по их воспоминаниям, "жили…немалое время своевольно, ни под чьею державою". Подобно донцам, яицкие казаки первоначально жили небольшими общинами, образовавшимися вокруг городков. Единая казачья область (Войско) возникла на Яике в 50-е гг. XVII в. В воинском искусстве яицкие казаки не уступали донцам, поддерживая с ними тесную связь, получая оттуда пополнения и помощь, а в случае необходимость и укрытие. В 1636-1637 гг. в донском городке Голубые проживал И.Я. Поленов, который в 1636 г. был есаулом в войске яицких казаков, взявших персидский город Фарабад.
6 апреля 1579 г., за два года до разгрома Сарайчика, большой отряд волжских казаков (540 человек), был нанят на службу крупнейшими русскими солепромышленниками Строгановыми. Владения этих купцов, находившиеся на восточных границах Московского государства, постоянно тревожили набегами сибирские татары и подвластные им племена хантов и манси. Казачье войско, во главе которого стоял атаман Ермак Тимофеевич, понадобилось Строгановым не для обороны, а для нападения. Количество нанятых купцами казаков было действительно велико (оно заметно превосходило число, например, всех гребенских и терских казаков), однако Строгановы еще больше увеличили его за счет собственных отрядов. 1 сентября 1581 г. в поход за Уральские горы выступило около 1500 воинов, вооруженных самым современным для того времени оружием, в том числе семипяденными пищалями и испанскими аркебузами. Кроме Ермака казачью армию возглавляли атаманы И. Кольцо, Я. Михайлов, Н. Пан и М. Мещеряк. Закаленное в боях с ногайцами, казачье войско сравнительно легко сломило сопротивление сибирских татар и разгромило Орду Кучума. На завоеванных в Западной Сибири территориях стали возникать русские города и остроги, гарнизоны которых состояли преимущественно из служилых казаков. Первой столицей русской Сибири стал Тобольск, где в 1638 г. было 102 конных и 525 пеших казаков, а в 1651 г. 109 конных и 368 пеших казаков, не считая казаков так называемого "литовского списка", которые несли службу вместе с иноземцами. При сопоставлении цифр бросается в глаза значительное сокращение числа пеших казаков, по-видимому, переведенных в остроги Восточной Сибири.