Оптимальное исходное значение рН среды зависит от особенностей продуцента, но можно выделить общие закономерности. Грибы и дрожжеподобные организмы хорошо растут и образуют ферменты в средах с рН от 3,8 до 5,6. Бактерии лучше всего развиваются при рН, близком к нейтральному (6,2-7,4). В зависимости от состава среды и продуктов метаболизма рН среды может сдвигаться как в кислую, так и в щелочную зону. Большинство микроорганизмов очень чуствительно к уровню рН среды, и малейшее отклонение значения рН от оптимального приводит к резкому снижению способности микроорганизмов образовывать ферменты.
I.3 Температура культивирования
Большинство продуцентов ферментов, особенно микроскопические грибы, является мезофильными микроорганизмами, и оптимальная температура их развития равна 22-32 градуса С. Среди бактериальных продуцентов ферментов часто встречаются термофильные микроорганизмы, для которых оптимальная температура культивирования составляет 35-55 градусов С. Термофильные микроорганизмы представляют особый интерес для промышленного использования, так как культивирование при высоких температурах создает селективные условия для их развития и позволяет снизить требования к стерильности процесса. Кроме того, термофильные микроорганизмы синтезируют ферменты, обладающие повышенной термостойкостью. Температура оказывает большое влияние на скорость накопления ферментов. Если микроорганизм термостабилен, то с повышением температуры культивирования возрастает скорость накопления фермента, а иногда и суммарное количество синтезируемого фермента.
I.4 Влажность питательной среды при поверхностном культивировании
Влажность среды при выращивании продуцента ферментов на твердых сыпучих средах имеет большое значение, так как при влажности среды от 11 до 20% развитие микроорганизмов почти невозможно.
Небольшой рост начинается при влажности свыше 30%. Влажность 40-45% считается неблагоприятной и способствует обильному спорообразованию культуры. При влажности среды 53-68% наблюдается наибольшее накопление ферментов. Оптимальная влажность зависит во многом от продуцента, но в основном от физического состояния среды при данной влажности. При влажности 60-68% наблюдается спад биосинтеза ферментов из-за ухудшения проницаемости среды для воздуха. Высокая влажность способствует слипанию частиц среды, нарушению рыхлой структуры и ухудшению условий роста культуры и биосинтеза ферментов. При поверхностном культивировании с ростом культуры происходит заметное уменьшение содержания сухих веществ, которые превращаются в СО2 и Н2О. Если культивирование ведется в закрытых емкостях, где испарение влаги ограничено, то по мере роста культуры наблюдается некоторое увеличение влажности. Если культура выращивается в открытых емкостях при интенсивном аэрировании, то наблюдается ее подсушивание, которое может повлечь за собой уменьшение продуцирующей способности культуры и снижение активности в готовом продукте.
Оптимальная влажность и ее уровень при культивировании во многом зависят от физиологических способностей продуцента, состава среды и ее сыпучести, и в каждом конкретном случае определяются экспериментально.
I.5 Аэрирование растущей культуры
Степень аэрирования во многом определяется способом культивирования и физиологией микроорганизмов – продуцентов ферментов. Аэрирование растущей культуры преследует три цели: снабжение микроорганизма необходимым для роста и развития количеством кислорода; удаление с отходящим воздухом газообразных продуктов обмена; частичное снятие и отвод выделяемого микроорганизмом в процессе роста физиологического тепла. При поверхностном культивировании самое большое значение придается вопросу отвода воздухом тепла. Чем интенсивнее аэрирование, тем глубже идут окислительные процессы, больше потребляется сухого вещества среды на дыхание и тем меньше выход готовой культуры. Процесс интенсивного окисления органических веществ среды сопровождается выделением большого количества тепла.
Для расчета необходимого воздухообмена обычно строят график тепловыделения за весь период выращивания микроорганизма, так как в зависимости от состава среды и вида микроорганизма кривые тепловыделения будут различны. Расход воздуха при поверхностном способе культивирования для снятия тепла приблизительно в 90-100 раз превышает физиологическую потребность в нем микроорганизмов, поэтому процесс подвода О2 к культуре и отвода углекислоты не является лимитирующим.
Аэрирование глубинной культуры является важным фактором и его интенсивность по-разному влияет на продуцирующую способность различных микроорганизмов. Даже один и тот же микроорганизм при различной степени аэрирования неодинаково накапливает отдельные ферменты. В целом же увеличение степени аэрирования среды приводит к интенсификации процесса биосинтеза ферментов и в большинстве случаев к сокращению длительности культивирования.
Количество воздуха расходуемого на аэрирование, определяется степенью растворения кислорода в среде, которая зависит от вязкости среды и конструктивных особенностей ферментатора и поэтому в каждом случае требует экспериментального изучения и уточнения.
I.6 Длительность культивирования
Скорость роста отдельных штаммов неодинакова. Оптимальная длительность культивирования, обеспечивающая максимум накопления ферментов, устанавливается экспериментально. Она зависит от очень многих факторов: состава среды и способа ее подачи при культивировании, степени аэрирования среды, от того, является ли фермент внеклкточным или внутриклеточным, от рода продуцента и др. Например, дополнительное введение среды (подпитка) в начальной стадии роста позволяет на 30-40% сократить длительность культивирования и значительно повысить продуктивность микроорганизмов. Прогнозировать оптимальную длительность выращивания очень сложно и требуется ее экспериментальное определение.
I.7 Стерилизация питательных сред и аппаратуры
Целью стерилизации является уничтожение всей микрофлоры, которая находится в питательной среде, различных жидких добавках (пеногасители), а также на внутренних поверхностях оборудования, арматуры, подводящих и отводящих коммуникаций.
Необходимость стерилизации вызвана тем, что культуры – продуценты ферментов крайне чувствительны к присутствию других микроорганизмов.
Процесс стерилизации можно расчленить на три основных этапа: нагревание среды или аппарата до температуры стерилизации, выдерживание при этой температуре в течении времени, обеспечивающего гибель всех микроорганизмов и охлаждение стерилизуемого объекта до температур, доступных для засева среды чистой культуры продуцента. Достичь полной стерилизации очень трудно, поскольку для этого надо убить все микроорганизмы, а некоторые из них, особенно спороносные, выдерживают воздействие высоких температур очень длительное время. Свойства стерилизуемых объектов имеют большое значение, так как некоторые вещества усиливают стерилизующий эффект, например, кислоты, а некоторые, наоборот, увеличивают стойкость микроорганизмов к температуре и давлению. Эффективность стерилизации зависит от очень многих факторов: температуры, длительности процесса, состава стерилизуемой среды, конструкции аппарата, степени обсемененности стерилизуемого объекта, требований стерильности на последующих стадиях и т.д.
При поверхностном способе выращивания различных микроорганизмов требуется различная степень термической обработки среды. Если среда в процессе культивирования не перемешивается и не перемещается, то ее абсолютная стерильность необязательна. Обработка среды осуществляется при различных режимах. Стерилизуют аппаратуру для приготовления посевного материала (емкости для засева, кюветы, емкости для воды, для приготовления посевной суспензии, посевные коммуникации), а также производственные кюветы.
При стерилизации жидких питательных сред на выбор оптимального режима стерилизации оказывают влияние гетерогенность жидкой среды, ее физико-химические свойства, качественный и количественный состав. Если среда не содержит твердых частиц и представляет собой гомогенный раствор питательных веществ, то длительность стерилизации при прочих равных условиях может быть меньше, чем для сред, содержащих твердые частицы, так как для их прогревания требуется больше времени. Большее время стерилизации требуется в случае, если в среде есть липиды и она имеет высокое содержание сухого вещества. При наличии в составе среды редуцирующих сахаров, особенно глюкозы и свободных аминокислот, стерилизацию углеводной и аминокислотной фракций следует вести отдельно, чтобы избежать потери сахаров в результате меланоидинообразования. Стерилизация аппаратов и коммуникаций имеет большое значение и при глубинном способе культивирования. Самая тщательная стерилизация может не дать эффекта, если нарушена герметичность оборудования.
При стерилизации оборудования есть опасность даже при высоких температурах не добиться стерильности в результате того, что в процессе тепловой обработки внутренних полостей аппаратов происходит конденсация пара у стенок. Воздух, выделяющийся из парогазовой смеси, покрывает стенки аппарата воздушной пленкой, в результате чего условия нагревания стенки ухудшаются. Плохо поддаются стерилизации различные патрубки и люки, так как в них образуются воздушные пробки. Для улучшения условий стерилизации при конструировании аппаратуры следует сокращать число впаев, увеличивать диаметр и уменьшать высоту отводящих и подводящих штуцеров. Особое внимание уделяется стерилизации аппаратуры и коммуникации для подачи пеногасителя.
На стадии стерилизации ведется постоянный микробиологический контроль стерильности питательной среды, подаваемого в ферментатор воздуха, пеногасителя и т.д. На микробиологическую чистоту проверяют отделение стерилизации, его стены и пол, аппаратуру, коммуникации, а также руки работающих.