Отбор проб для органолептических и химических испытаний
Из отобранных единиц продукции берут точечные пробы и из них составляют объединенные пробы.
Определение общего количества микробов в 1 г продукта
Метод не распространяется на сырокопченые колбасы.
Сущность метода заключается в способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре (30 + 0,5)0C с образованием колоний, видимых при увеличении 5*.
Проведение анализа
Питательный агар расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 450C. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта. Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одну чашку Петри проводят посев 0,1 г, а на другую – 0,01 г продукта.
Для посева 0,1 г продукта готовят первое десятикратное разведение испытуемой взвеси: стерильной пипеткой с широким концом отбирают 5 см3 испытуемой взвеси (приготовленной по), переносят ее в пробирку с 5 см3 стерильного физиологического раствора или пептонной воды. Конец пипетки должен быть опущен ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. 1 см3 полученного раствора содержит 0,1 г испытуемого продукта. Другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки продуванием, отбирают 1 см3 и переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,01 г продукта готовят следующее разведение: другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают 1 см3 и переносят в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора. 1 см3 испытуемого раствора вторичного разведения содержит 0,01 г испытуемого продукта. 1 см3 этого раствора переносят в стерильную чашку Петри, как описано выше. При необходимости таким же образом готовят следующие разведения. После внесения разведения анализируемой взвеси в чашки Петри чашку заливают 12 – 15 см3 расплавленного и охлажденного питательного агара при фламбировании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Быстро смешивают с мясопептонным питательным агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых участков дна чашки Петри, попадания среды на края и крышку чашки.
Для того, чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий группы протея в Н-форме, допускается наслоение расплавленного и охлажденного до температуры 45 – 50 °С голодного агара толщиной 3 – 4 мм. После застывания агара чашки Петри перевертывают и помещают в термостат с температурой 30 0C на 72 ч. Через 72 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на чашках. Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
Обработка результатов
Для определения общего количества микробов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимают среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта.
Сущность метода заключается на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах «ХБ», Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления лактозы. Цель определения этой группы бактерий – проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации.
Проведение анализа
В пробирки, содержащие по 5 см3 – среды «ХБ», среды Хейфеца двойной концентрации или среды КОДА, вносят по 5 см3 испытуемой взвеси стерильной пипеткой вместимостью 5—10 см3 с широким концом.
Допускается применение среды Кесслер по 10 см3.
Пробирки со средой «ХБ» или Кесслер, или Хейфеца, или КОДА помещают в термостат с температурой (37 ± 0,5) °С на 18 – 20 часов.
Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 °С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения).
При росте бактерий группы кишечной палочки среды «ХБ» и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца приобретает также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.
Для окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца ( изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева, или Левина. Чашки Петри помещают в термостат с температурой 37 °С. Через 18 – 20 ч посевы просматривают. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева — кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина — темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму.
Специфическое изменение среды «ХБ» и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсеменности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помещают в пустую пробирку, в которую закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5x5 см, и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливают среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3/4 высоты пробирки. Пробирки помещают в термостат с температурой 37 °С на 8 – 10 ч. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде «ХБ» и КОДА среда изменяет свой цвет из фиолетово-пурпурного в желтый. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, которым затем может меняться до салатно-зеленого.
Пробы, отобранные с поверхности изделий без оболочки тампонами, анализируют аналогично.
Обработка результатов
Обнаружение грамотрицательных не образующих спор палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта.
Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств.
Проведение анализа
Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносят во флакон Сокслета, содержащий 100 см3 среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 см3. Флаконы тщательно встряхивают и помещают в термостат с температурой 37 °С. Через 16 – 24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0,4—0,5 мм) или пастеровской пипетки проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору).
Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 °С; посевы просматривают через 16 – 48 ч, на висмут-сульфит-агаре — через 24 – 48 ч.
На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образует бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы, как и на среде Эндо — мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы и группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.
Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помещают на 12 – 16 ч в термостат с температурой 37 °С.
При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука – розовый, столбик — желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, сероводородообразующие – вызывают потемнение столбика.