При отсутствии гомогенизатора допускается приготовление испытуемой взвеси в ступке. 20 г продукта растирают в стерильной фарфоровой ступке с 2—3 г стерильного песка, постепенно приливая 80 см3 стерильного физиологического раствора (или 0,1%-ного раствора стерильной пептонной воды). При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные, кровяные колбасы) стерильный песок можно не добавлять.
Взвесь 15 мин выдерживают при комнатной температуре и отбирают для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой. В 1 см3 приготовленной взвеси содержится 0,2 г продукта.
Мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы
Для определения МАФАнМ из каждой пробы делают не менее двух различных по объему посевов, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. В одну чашку Петри проводят посев 0,1 г, в другую — 0,01 г продукта.
Предварительно готовят первое 10-кратное разведение испытуемой взвеси. Стерильной пипеткой с широким концом отбирают 5 см3 испытуемой взвеси, переносят ее в пробирку с 5 см3 стерильного физиологического раствора или пептонной воды. Конец пипетки надо опускать ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. В 1 см3 полученного раствора содержится 0,1 г продукта. Другой стерильной пипеткой содержимое пробирки тщательно перемешивают продуванием, отбирают 1 см3 и переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,01 г продукта готовят второе 10-кратное разведение: стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки с первым разведением, отбирают 1 см3 и переносят в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора. 1 см3 вторичного разведения, содержащего 0,01 г продукта, переносят в стерильную чашку Петри. При необходимости таким же образом готовят последующие разведения.
Не позднее чем через 15 мин к внесенной в чашки Петри испытуемой взвеси добавляют по 12—15 см3 мясопептонного агара, расплавленного на водяной бане и охлажденного до 45 ± 1 °С. Края пробирки или бутылки с агаром обязательно фламбируют. Добавленный агар быстро смешивают, осторожно наклоняя чашку или вращая ее по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, следить, чтобы не оставались незалитые участки дна чашки, среда не попадала на края и крышку чашки.
Для предотвращения роста на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий группы протея в Н-форме рекомендуется наслоить расплавленный и охлажденный голодный агар в количестве 1/3 объема первоначально внесенной в чашку среды. В результате образуется слой толщиной 3—4 мм.
После застывания агара чашки Петри перевертывают и помещают в термостат при 37 "С. Через 48 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на поверхности и в глубине агара, при помощи лупы с 5-кратным увеличением или специальным прибором. Для этого чашку кладут дном вверх на черный фон и каждую колонию отмечают тушью или чернилами для стекла, чтобы не сосчитать ее повторно.
При определении общего количества МАФАнМ в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта по каждой чашке и выводят среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек с разной массой продукта.
Бактерии группы кишечных палочек
Цель определения бактерий этой группы — проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий. Анализ на БГКП проводят по общепринятой методике с использованием сред, содержащих углеводы (глюкоза, лактоза). К ним относятся среды Хейфеца, ХБ, КОДА, Кесслер. БГКП ферментируют глюкозу и лактозу, поэтому в средах ХБ, Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления глюкозы.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации. Для выявления БГКП в пробирки с 5 см3 среды ХБ или Хейфеца двойной концентрации либо КОДА вносят по 5 см3 испытуемой взвеси стерильной пипеткой с широким концом вместимостью 5—10см3. Допускается применение среды Кесслер по 10см3.
Посевы термостатируют при 37 °С в течение 18—20ч. Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 °С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения). При росте бактерий группы кишечной палочки среды ХБ и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца — в салатно-зеленый, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.
Для окончательного заключения о присутствии в продукте БГКП проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробы) или Хейфеца (изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо (Плоскирева, Левина) и помещают в термостат при 37 °С на 18— 20 ч. На среде Эндо бактерии этой группы образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева — кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина — темно-фиолетовые или фиолетово-черные блестящие колонии. Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашенные по Граму: при микроскопии обнаруживают грамотрицательные палочки различной величины.
Специфическое изменение сред ХБ и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсеменности анализируемого продукта его навеску массой не более 0,25 г помещают в пустую пробирку, закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5 х 5 см и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают его до дна (не уплотняя). В пробирку наливают среду ХБ, КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации) на 3/4 высоты и помещают ее в термостат с температурой 37 °С на 8—10ч. При росте БГКП среды ХБ и КОДА изменяют цвет из фиолетово-пурпурного в желтый, среда Хейфеца — из красно-фиолетового до салатно-зеленого.
Определение БГКП в пробах, отобранных с поверхности изделий без оболочки тампонами, осуществляют аналогично.
Обнаружение грамотрицательных палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие БГКП.
Сальмонеллы
Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы, тщательно измельченной стерильными ножницами, вносят во флакон Сокслета, содержащий 100см3 среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой) или 225 см3 селенитового бульона. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 °С. Через 16—24 ч содержимое флакона тщательно перемешивают бактериологической петлей (диаметр 0,4—0,5 мм) или пастеровской пипеткой и проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору). При значительном помутнении следует использовать среду Плоскирева.
Посевы помещают в термостат при 37 °С на 16—24 ч. На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы растут в виде крупных, гладких, красноватого оттенка прозрачных колоний (колонии S. typhi suis как и на среде Эндо, мелкие). Колонии БГКП желто-зеленого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.
На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, но более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо; при обильном росте среда желтеет.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы образуют черные или коричневые колонии с металлическим блеском, участок среды под колонией чернеет. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, растущие на этой среде в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.
Изолированные колонии (не менее 5), характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 12—16 ч.
При росте сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде — Олькеницкого в модификации Ковальчука розовый, столбик желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, образующие сероводород виды вызывают потемнение столбика.
Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают следующие изменения цвета трехсахарного агара:
БГКП — равномерное окрашивание в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;
бактерии из группы протея — окрашивание в ярко-красный цвет, в случаях выделения Н2S может образоваться черный осадок;
шигеллы и возбудители брюшного тифа окрашивают скошенную поверхность в розовый цвет, столбик — в синий или сине-зеленый.
Вместо среды Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука допускается посев: на углеводные среды короткого пестрого ряда с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой; полужидкий агар уколом (для определения подвижности); бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода. При использовании полужидких сред с углеводами и индикатором ВР одновременно с ферментативной активностью можно определить подвижность бактерий.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют и изучают анти-генные свойства путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток. Установив серологическую группу исследуемых бактерий, с помощью Н-сывороток определяют тип (вид) бактерий.