Найбільша заслуга в національно-культурному піднесенні кінця XVI—початку XVII ст. належала братствам. Вони увібрали в себе кращі традиції давньоруських братчин та організаційні елементи цехів і гільдій і найповніше відображали інтереси міщанства та інших верств населення. Наприкінці 1585 р. оформилося Успенське братство у Львові, Рогатині та Красноставі (1589), Бресті та Городку (1591), Комарні (1592), Києві (1615), Луцьку (1617), а також у ряді менших міст та містечок. Засновниками братств у Львові стали міщани, у Луцьку й Києві поряд з ними активну роль відігравало духовенство та шляхта. Київська шляхтянка Гальшка Гулевичівна подарувала братству свій маєток під школу й шпиталь. Організаційну роботу по створенню братства виконали ченці Захарія Копистенський, Тарас Земка, Курцевич-Булига. Колективним його членом стало Військо Запорізьке на чолі з гетьманом Петром Конашевичем-Сагайдачним. Братства існували на членські внески братчиків і добровільні пожертвування православних шляхтичів, церковників і міщан.
Українські братства виступали проти засилля духовенства в суспільному житті, за право міських громад брати участь в управлінні церковними справами й контролі за діяльністю єпископів. Львівські братчики активно протидіяли намаганням львівського православного єпископа Гедеона Балабана підкорити собі товариство, обмежити доступ міщан до освіти. У 1598 р. вони вийшли з-під влади єпископа й домоглися участі в призначенні й зміщенні священиків. Але боротьба на цьому не припинилася й тривала до 1602 p., коли Балабан був змушений визнати братський статут і відмовитися від наміру передати єпархію у спадок своєму племінникові. Братство протестувало проти обмеження прав православних ремісників вступати до цехів, тяжкого становища міщан і закликало до єднання в боротьбі за існування українського народу. Таку саму боротьбу вели Рогатинське, Городоцьке та інші братства, поступово відвойовуючи у духовенства дедалі більше позицій у суспільному житті.
Братства підтримували між собою тісний зв'язок і намагалися поширити ідеї на інші регіони, для чого обмінювалися статутами й виряджали до інших міст найкращих проповідників. У 1593 р. до Вільно відправилися один з організаторів Львівського братства Юрій Рогатинець та його визначний ідеолог вчитель Стефан Зизаній. Рогатинець незабаром повернувся до Львова, а Зизаній повів, як писали сучасники, «запеклу й велику війну з римчанами (католиками. — Авт.). Незважаючи на королівські та єпископські заборони, Зизаній продовжував ідеологічну боротьбу з католиками до 1599 р.
Значний внесок зробили братства і в розвій українського шкільництва, яке об'єктивно протистояло лінії властей на покатоличення українського народу. Основоположним принципом в освітній діяльності братств стала теза, що з науки «все доброе приходить», а занедбання її викликає «неряд і все зло». Хоча навчальні заклади існували й до цього, але з появою братських шкіл підвищується рівень викладання й поглиблюється зв'язок освіти з національним життям. Вже перша львівська братська школа, відкрита наприкінці 1585 р., мала елементи вищої освіти. Школа мала всестановий характер, у ній вчилися діти як заможних, так і бідних батьків, сироти. Хоч школа і називалася греко-слов'янською, але навчання у ній зводилося, за тодішнім виразом, до «українських студій», що визначало її національно-освітній характер. У 1615 р. на кошти Гальшки Гулевичівни відкрилася братська школа у Києві. До її організації чимало праці й хисту доклали перший ректор Іов Борецький, а в 1620—1624 pp. — Касіян Сакович. Архімандрит Києво-Печерської лаври Петро Могила визнавав надзвичайно високий авторитет братської школи й після свого вступу до братства та відкриття школи при Києво-Печерській лаврі об'єднав їх у 1632 р. в київську колегію. Так українські братства започаткували вищу освіту в Україні.
Конфесійна боротьба. У XVIст. дедалі більша кількість Православної шляхти та магнатів переходила в католицизм і ополячувалася. Одні робили це за покликом душі, інші Під тиском. Загострилася конфесійна боротьба, яка часто набирала насильницьких дій, у тому числі фізичних розправ з неугодними. Католицьке віросповідання стало офіційною релігією на всіх землях Речі Посполитої й всіляко підтримувалося властями.
Головною метою правлячих кіл у конфесійній справі стало покатоличення українського населення й підпорядкування православної церкви Ватикану. Після Тридентського собору в конфесійну боротьбу активно втрутився орден єзуїтів. З'явившися в Польщі в 1566 p., єзуїти поширили свою діяльність і в Україні. Для досягнення мети, або, як було записано в настановах ордену, «для збільшення слави божої» єзуїти не гребували нічим. Разом з тим вони організували мережу єзуїтських шкіл, де виховували українську молодь в єзуїтському дусі. Школи мали висококваліфікованих учителів, які давали вихованцям ґрунтовну освіту й особливо вміння дискутувати. Єзуїтські заклади закінчило чимало видатних громадських діячів, і не всі вони стали переконаними католиками чи єзуїтами.
Незабаром після появи в Україні єзуїти почали пропагувати ідею об'єднання православної та католицької церков. Вона знайшла широку підтримку серед католиків і частини православних ієрархів, які вагалися у своєму виборі, але заради зміцнення власних позицій й православ'я в цілому ішли на компроміс з католицькою церквою. В 1695 р. православні єпископи (володимирський Іпатій Потій і луцький Кирило Терлецький) почали таємні переговори з польським королем Сигізмундом III і римським папою про унію католицької й православної церков. У зверненні до папи вони погоджувалися визнати верховенство Ватикану, догматів католицизму й одночасно просили зберегти церковну обрядність та церковнослов'янську мову в богослужінні, зрівняти уніатів у правах з католиками. 6—10 жовтня 1596 р. у Бресті відбувся собор для прийняття унії. З самого початку він розколовся на православний і уніатський. Православний — відкинув унію, уніатський — прийняв її. Відповідну грамоту підписали митрополит, п'ять єпископів і три архімандрити. Уніатський собор визнав владу папи римського й догмати католицької церкви, зберіг православні обряди й церковнослов'янську мову в богослужінні. Уніати діставали великі привілеї — церковники звільнялися від податків, шляхтичам відкривався доступ до державних посад, міщани зрівнювалися в професійних правах з католиками. Православна релігія була поставлена у складні умови. Православні ієрархи замінювалися уніатськими, у монастирів відбиралися маєтності, а самі вони перетворювалися на уніатські. Православні купці, ремісники та шляхтичі обмежувалися в правах. Проти Брестської церковної унії виступили православне духовенство, частина православної шляхти, магнат Костянтин Острозький і просте населення. Якщо шляхта й духовенство діяли переважно шляхом скарг, прохань, відстоювань своїх прав на сеймиках, то прості віруючі вдавалися до активного опору покатоличенню. Київські міщани у 1599 р. не впустили до міста призначеного польським королем архімандритом Києво-Печерської лаври Потія. У 1618 р. втопили в Дніпрі намісника уніатського митрополита Антонія Грековича. Виступи православного населення проти уніатського духовенства відбувалися пізніше й в інших містах. Тим часом в Україні визрівала думка про самовільне відновлення православної церкви. У 1620 р. були обрані православні владики, з чим влада мусила примиритися, щоб дещо зняти конфесійну напругу. Але зробити це не пощастило. Церковна боротьба переросла на визвольну й загрожувала існуванню польсько-шляхетської влади в Україні. Під тиском конфесійно-визвольного руху польський король Владислав у 1632 р. затвердив «Статті для заспокоєння руського народу», які офіційно визнали існування православної церкви, їй поверталася частина захопленого майна, поряд з уніатськими дозволялися православні єпархії. При цьому польський уряд мав широкі можливості впливати на обрання православних митрополитів. Одні з них виявилися угодовцями й не залишили помітного сліду в історії православ'я. Інші сприяли розвитку української національної культури й православної віри. Серед них найсільніше місце займав києво-печерський архімандрит, а з 1632 р. митрополит київський і галицький Петро Могила. Він виступав проти унії, домагався повернення православній церкві Видубицького монастиря, Софійського собору в Києві, інших монастирів та маєтностей, сприяв письменникам і художникам, розвиткові книгодрукування та освіти, писав полемічні твори проти унії. Однак попри всі дії патріотично настроєної української громадськості наступ уніатства на релігійно-національні права українського народу не припинявся.
Україна в уявленні іноземців. Українські землі здавна перебували в полі зору урядів, учених, релігійних діячів зарубіжних країн. З татаро-монгольською навалою і втратою Україною державності їхній інтерес до неї слабшав, а з пожвавленням визвольного руху й перетворенням українського питання на епіцентр міждержавних відносин Польщі, Литви, Угорщини, Криму й Московщини знову посилився. В свідомості іноземців українські землі залишалися окремим регіоном, що мав етнічні кордони, особливості в побуті, культурі та мові місцевого населення.