Великий князь Василий Иванович выделил большую сумму денег для строительства собора и других монастырских сооружений, а кроме того, пожаловал вновь основанной обители земельные угодья. Традиционно оказывать материальную поддержку Новодевичьему монастырю продолжали и другие правители Московского государства. Так, Иван Грозный в 1583 году освободил обитель от уплаты налогов, выдав об этом соответствующую грамоту. Но особенно отличились щедрыми дарами в пользу Новодевичьего монастыря царь Борис Федорович Годунов и царевна Софья Алексеевна.
Первым каменным зданием создаваемой обители стал Смоленский собор, посвященный Богоматери. Строился этот храм на протяжении четырнадцати лет. В то же время из дерева сооружались другие постройки - жилые и хозяйственные помещения, а также крепостные стены с башнями и проездными воротами - непременная принадлежность старинных русских монастырей. К моменту создания Новодевичьего монастыря на подступах к Москве с юга и юга-востока уже существовали монастыри-крепости: Данилов, Симонов, Новоспасский. Однако и новая обитель, расположенная на месте пересечения важных сухопутных и водных путей, приобрела большое стратегическое значение.
Созданию более мощных, каменных укреплений, предшествовали, однако, некоторые весьма примечательные события.
Еще со времен Ивана Грозного в Новодевичьем монастыре принимали постриг жены и дочери опальных князей и бояр и даже некоторые царские родственницы. А в январе 1598 года, после кончины царя Федора Ивановича, вдова последнего, Ирина Годунова, также изъявила желание провести остаток жизни в посте и молитве вдали от суетного мира. Она отказалась от предложенного ей царства и удалилась в Новодевичий монастырь, где постриглась с именем Александры. Покинул Москву и фактический правитель государства - Борис Годунов. Он приехал в Новодевичий монастырь и остановился у своей сестры.
Тем временем патриарх Иов и другие сторонники Годунова не бездействовали, а сумели склонить народ просить на царство Бориса Федоровича. В феврале 1598 года в Москве состоялся Земский собор, на котором царем был избран уже показавший себя разумным правителем Борис Федорович Годунов.
Трижды толпы москвичей ходили к Новодевичьему монастырю приглашать Годунова на престол. Дважды Борис отказывался. Наконец, состоялся последний крестный ход, возглавленный патриархом Иовом. После совершения литургии в монастырском соборе патриарх и бояре пришли в келью Ирины, где находился тогда Борис, и только на этот раз он согласился вступить на престол. В Смоленском соборе Новодевичьего монастыря Борис Годунов был наречен на царство, а торжественное венчание на царство состоялось уже в кремлевском Успенском храме.
С тех пор Борис Годунов оказывал Новодевичьему монастырю особое покровительство. Именно на его щедрые пожертвования в начале XVII века были сооружены здесь первые каменные крепостные стены и башни.
Линия укреплений достигла девятисот метров, охватывая площадь, равнявшуюся приблизительно пяти гектарам. Стены первоначально не имели столь характерных для них зубцов в форме ласточкина хвоста - по крайней мере, так они представлены на старинных изображениях. Высота стен достаточно внушительная - до одиннадцати-тринадцати метров, ширина - около трех метров. Как и в других русских крепостях данного периода, здесь были представлены три боевых яруса - галереи для верхнего боя, бойницы для среднего и подошвенного боя. В систему укреплений входили двенадцать боевых башен. Башни завершались высокой скатной кровлей. Главные ворота, ведущие в монастырь, располагались с северной стороны.
Для охраны крепости был определен гарнизон стрельцов, достаточно многочисленный. Однако находиться воинам в пределах женского монастыря не полагалось, и потому они имели доступ только к крепостным стенам и башням, а от остальной монастырской территории были ограждены. По некоторым данным, к концу XVII века около всех четырех угловых башен находились каменные караульни, отделенные высоким деревянным забором от остальной площади. Там размещались стрельцы (по триста пятьдесят человек в каждой караульне), а на первых этажах некоторых башен были устроены арсеналы.
Если в годы царствования Бориса Годунова Новодевичий монастырь достиг определенного процветания благодаря щедрым государевым пожертвованиям, то во время Смуты в начале XVII столетия на долю обители выпало множество скорбей и невзгод.
В 1610 году, когда на московское царство Боярская дума избрала королевича Владислава, к столице были допущены польские отряды. При этом несколько рот из пехотных полков и часть кавалеристов из войска гетмана Жолкевского оказались размещены в Новодевичьем монастыре. А весной 1611 года, когда к Москве подошли воины первого земского ополчения, в Новодевичий монастырь ворвались отряды поляков и немецких наемников, и остававшиеся еще в обители инокини были уведены в войсковой стан, а сам монастырь разграблен и сожжен.
В августе 1612 года близ монастырских стен происходили сражения второго земского ополчения с войском гетмана Ходкевича. Именно со стороны Новодевичьего монастыря неприятели пытались прорваться на помощь к находившемуся в Китай-городе и Кремле польскому гарнизону, но у Чертольских ворот встретили упорное сопротивление воинов К. Минина и Д. Пожарского. Гетман Ходкевич был вынужден отступить. Поляки прошли через Новодевичий монастырь на Воробьевы горы, а оттуда - к Донскому монастырю.
Борьба за освобождение русской столицы продолжалась еще некоторое время. Но, лишенный продовольствия и подкреплений, польский гарнизон был обречен. 22 октября 1612 года русские штурмом взяли Китай-город, а затем был сдан и Кремль. Москва избавилась от интервентов. Постепенно стал восстанавливаться государственный порядок на территории России. Сказалось это и на судьбе Новодевичьего монастыря - в разоренную обитель возвратились успевшие скрыться в безопасном месте монахини. Привезли уцелевшие иконы, книги, церковную утварь.
Несмотря на пережитые монастырем в годы Смуты бедствия, он по-прежнему оставался местом пострижения многих знатных лиц. Даже в трудные и опасные времена здесь находились, хотя и не постоянно, Ксения Годунова (в период правления Лжедмитрия I), а затем жена свергнутого царя Василия Шуйского и мать Михаила Федоровича Романова.
В середине XVII века, при царе Алексее Михайловиче, произошло воссоединение Украины с Россией. Это важное в истории государства, но, казалось бы, далекое от тихой иноческой жизни событие, все же не прошло бесследно и для Новодевичьего монастыря. С этого времени монастырь на долгие годы стал местом пребывания православных инокинь с Украины и из Белоруссии.
Наибольшего же расцвета Новодевичий монастырь достиг в годы правления дочери царя Алексея Михайловича, царевны Софьи.
После смерти царя Федора Алексеевича обострилось противоборство за власть между двумя придворными группировками, одна из которых хотела видеть на престоле Ивана Алексеевича (сына Марии Милославской), а другая - Петра Алексеевича (сына Натальи Нарышкиной). В мае 1682 года стрельцы, подстрекаемые Милославскими, подняли в Москве бунт и расправились с некоторыми видными представителями противоположной партии. В результате этих событий власть фактически перешла к царевне Софье Алексеевне, назначенной регентшей при неспособных самостоятельно править царях - болезненном Иване и малолетнем Петре. Софья, именовавшаяся государыней, распоряжалась делами в столице, а ее младший брат Петр вместе с его матерью были удалены из царского дворца и жили в подмосковных селах. Однако положение правительницы оставалось непрочным, срок ее властвования был ограничен временем совершеннолетия Петра.
В 1682-1689 годах, когда царевна Софья стояла у власти, она давала щедрые пожертвования на Новодевичий монастырь, словно предчувствуя, что в этой обители ей суждено окончить свои дни. В этот период возводятся некоторые новые величественные здания, ремонтируются и украшаются те, что существовали и прежде. Если до конца XVII века в Новодевичьем монастыре было только два каменных храма - Смоленский собор и Амвросиевская церковь, то в 80-х годах указанного столетия в пределах обители сооружаются одно за другим несколько строений. Так, в 1685-1687 годах была возведена трапезная с двухэтажной Успенской церковью. Большое внимание уделяется южным и северным монастырским воротам. В 1683-1689 годах они перестраиваются, причем южный въезд в монастырь украшается надвратной Покровской церковью, а над северными воротами возводится шестиярусный пятикупольный Преображенский храм. Создаются и каменные жилые палаты, известные сейчас под наименованием Лопухинских и Мариинских. Сама царевна Софья во время посещения святой обители любила останавливаться в особых деревянных хоромах, просуществовавших до 1795 года. Помимо указанных зданий несколько позже, в 1689-1690 годах, была построена пятиярусная семидесяти двух метровая колокольня, после создания которой каменный ансамбль монастыря выглядел вполне завершенным.
При царевне Софье не были оставлены без внимания и крепостные стены и башни обители, выглядевшие слишком суровыми рядом с новыми нарядными сооружениями. Именно тогда старые башни получили украшение в виде ажурной каменной резьбы и многоцветную окраску, а стены были увенчаны двурогими зубцами в виде ласточкина хвоста. Крепостные сооружения Новодевичьего монастыря стали подобны другим наиболее значительным московским укреплениям - Кремлю, ограде Донского монастыря.
Конец правления царевны Софьи и, в связи с этим, дальнейшие перемены в судьбе монастыря, которому она оказывала покровительство, относятся к 1689 году. Царь Петр, уже достигший семнадцатилетнего возраста и женившийся, согласно понятиям современников, мог уже править самостоятельно и не нуждался в опеке со стороны старшей сестры. Пытаясь удержаться у власти, Софья вновь пыталась поднять стрельцов. Но на этот раз расстановка сил переменилась и такой поворот событий лишь ускорил устранение Софьи от государственных дел. К Петру I, перебравшемуся в Троице-Сергиев монастырь, подошли верные ему полки. На его сторону встали патриарх, большинство бояр. А Софья со своими сторонниками оказалась в изоляции и вскоре была устранена от управления страной. Власть полностью перешла в руки Петра I, а недавней правительнице Софье пришлось отправиться на жительство в облагодетельствованную ей Новодевичью обитель.