Мікрофлора ґрунту (стр. 2 из 2)

2. Метод підрахунку на агарових пластинках. Цей метод за своєю точністю значно поступається перед методом С. М. Виноградського та дає тільки орієнтовні дані, переважно про кількість аеробних мікробів у ґрунті. Проте внаслідок простоти і доступності його дуже часто застосовують у навчальних мікробіологічних лабораторіях. Згідно з цим методом ґрунтову суспензію висівають на тверді поживні середовища, вирощують на них колонії, підраховують та аналізують вирощені мікроорганізми.

Проведення роботи. Із зразка досліджуваного грунту відважують 1 г і роблять серію розведень у стерильній воді для одержання ґрунтової витяжки. Розведення готують так: у стерильну мірну колбу об'ємом 100 мл вносять 1 г грунту, додають 99 мл стерильної води і збовтують впродовж 3 хв. Потім відстоюють 1,5 хв. і роблять наступне розведення (рис. 36).

Для виготовлення кожного наступного розведення беруть окрему стерильну піпетку. У стерильні чашки Петрі стерильною піпеткою вносять 1 мл ґрунтової суспензії (наприклад, 1:100 000) і розподіляють рівномірно по дну. Розплавлене стерильне середовище (МПА, БПА, КАА, ґрунтовий агар) із пробірки виливають у чашку і, обережно похитуючи її, перемішують поживне середовище з ґрунтовою суспензією. З одного розведення готують 4—5 таких чашок.

Після застигання середовища для видалення крапель води з кришок чашки Негрі підсушують, позначають і ставлять у термостат при температурі 28—30°С на 3—5 діб. Потім підраховують (без відкривання кришки чашки) кількість колоній, що виросли на агарових пластинках. Найкращі результати одержуються при утворенні на чашках 20—50 колоній бактерій і 20—30 колоній грибів. Для підрахунку кількості колоній зручно користуватися спеціальними приладами для підрахунку колоній.

По закінченні підрахунків колоній визначають середнє з 4—5 чашок і множать на розведення, взяте для аналізу. У такий спосіб одержують кількість аеробних мікробів у 1 г сирого грунту. Для точних дослідів кількість мікроорганізмів визначається в 1 г повітряно-сухого, а найточніших — абсолютно сухого грунту. Для таких розрахунків треба водночас визначати вологість ґрунтової проби.

Кількість мікроорганізмів на 1 г повітряно-сухого грунту розраховують за такою формулою:

де А — кількість клітин мікробів у 1 г повітряно-сухого грунту;

Б — середнє число колоній мікроорганізмів у чашці Петрі;

В — відповідне розведення ґрунтової витяжки;

Г— кількість крапель у 1 мл рідини в піпетці;

Д — наважка грунту, взята для аналізу.

3. Метод пластинок обростання (за М. Г. Холодним). На відміну від наведених вище, цей метод дає можливість вивчати цілі мікробні асоціації безпосередньо в ґрунті, тобто в природному середовищі.

На рівній поверхні фунту роблять гострим ножем розріз, глибина якого залежить від досліджуваного ґрунтового горизонту. До вертикальної стінки зрізу щільно прикладають стерильне знежирене предметне скло, на 2—3 см нижче від поверхні грунту. Зверху зріз закривають ґрунтом. Місце, де встановлено скло, позначають. Залежно від мети досліду скло витримують у ґрунті 10—15 днів, а іноді й кілька місяців. Після цього обережно ножем знімають землю й виймають скло.

Поверхню скла, що була притулена до стінки ґрунтового розрізу, висушують на повітрі. Протилежну сторону скла витирають сухою ганчіркою. Препарат фіксують на полум'ї спиртівки. Потім предметне скло занурюють у банку з водою верхньою стороною донизу, внаслідок чого великі частинки грунту відмокають і падають на дно, а мікроби та дрібні частинки залишаються на склі. По закінченні промивання, препарат фарбують карболовим еритрозином (витримують від 30 хв. до 24 год.), висушують і вивчають під мікроскопом з імерсійною системою.

4. Груповий аналіз мікрофлори грунту. Диференційоване виділення з грунту різних фізіологічних груп мікроорганізмів та їхній аналіз можливі при використанні різних поживних середовищ.

Залежно від фізіологічної групи мікробів і методу досліджень застосовують різні елективні та диференціально-діагностичні поживні середовища (МНА, МПА + сусло-агар, КАА, середовища Виноградського, Ешбі, Гільтая, Імшенецького, Чапека та інші). За допомогою цього методу одержують значно більшу кількість мікроорганізмів, ніж користуючись методом пластинок обростання.

Можна рекомендувати виявити і вивчити такі фізіологічні групи: спороносні та неспороносні (пігментоутворюючі) форми бактерій на МПА; групу бацил (В. subtilis, В. mesentericus, В. megaterium, В. се-reus, В. idosus, В. mycoides та інші) на МПА + сусло-агар, міксобактерії на картопляному агарі, актиноміцети на КАА, гриби на сусло-агаровому середовищі тощо.

З ґрунтової проби відважують 10 г грунту, висипають його в конічну колбу об'ємом 250 мл, доливають 90 мл стерильної води і збовтують на спеціальному апараті протягом 10 хв. Щоб осіли грубі частинки, суспензію відстоюють, а потім виготовляють з неї серію розведень, і висівають на різні поживні середовища. Водночас відбирають з середньої проби 10 г грунту для визначення вологості, щоб перерахувати результати досліду на абсолютно сухий грунт.

Посів на м'ясо-пептонний агар (МПА). 1 мл ґрунтової суспензії потрібного розведення вносять у стерильну чашку Петрі, сюди ж вливають 12 мл попередньо розплавленого і охолодженого до 45°С МПА і старанно перемішують. Коли ставиться завдання систематизувати мікрофлору за типом колоній, то краще посів робити на поверхні агарових пластинок. Для виявлення бацилярних форм мікробів за Є.М. Мішустіним використовують змішане поживне середовище з МПА і сусло-агару (у відношенні 1:1). Перед посівом на це середовище ґрунтову суспензію прогрівають при температурі 70⁰ С протягом 15 хв для звільнення її від вегетативних форм бактерій.

Засіяні чашки Петрі позначають і розміщують у термостаті при температурі 25—30°С на 3—5 діб. Облік кількості колоній проводять на 3—4-й день. Вивчають культуральні та морфологічні ознаки мікроорганізмів і роблять відповідні висновки.

Посів на картопляний агар. Суспензію ґрунтового зразка (розведення 10~3) висівають на поверхню картопляного агару в чашках Петрі, розміщують у термостаті при температурі 25—30 °С і витримують 10—15 днів. За цей час на агарових пластинках з'являються плодові тіла міксобактерій різної форми і кольору. Препарати старанно вивчають візуально і мікроскопічно.

Посів на сусло-агар. На цьому середовищі можна виділити низку ґрунтових грибів: Mucor, Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Alternaria, Fusarium, Trichoderma та ін.

Перед змішуванням розплавленого сусло-агару з ґрунтовою суспензією до нього додають 2 мл стерильної молочної кислоти або 0,5 г стерильної лимонної кислоти (на 1 л середовища). Посів ґрунтової суспензії проводиться так само, як і на м'ясо-пептонний агар.

Мікроорганізми, які беруть участь у розкладі гумусових речовин, добре ростуть на водному агарі, а також на агаризованій ґрунтовій витяжці. Азотобактер і олігонітрофільні мікроорганізми можна виявляти на середовищі Ешбі.

Аеробні мікроорганізми, що розкладають клітковину, виявляють на рідкому поживному середовищі, склад якого розроблений О.О. Імшенецьким і Л.І. Солнцевою.