(15 +/- 1) мин.
7.18.3.2. Питательные среды
7.18.3.2.1. Подкисленная среда MRS
Состав:
- пептон 1 - 10 г;
- мясной экстракт - 10 г;
- дрожжевой экстракт - 5 г;
- глюкоза - 20 г;
- твин 80 - 1 куб. см;
- фосфат калия однозамещенный - 2 г;
- ацетат натрия тригидрат - 5 г;
- диаммоний цитрат - 2 г;
- сернокислый магний (MgSO х 7H O) - 0,2 г;
4 2
- сернокислый марганец (MnSO х 4H O) - 0,05 г;
4 2
- агар - 9 - 18 г;
- дистиллированная вода - 1000 куб. см.
Приготовление:
компоненты растворяют в кипящей воде. Охлаждают до 50 -С и с
помощью уксусной кислоты устанавливают рН таким образом, чтобы
после стерилизации рН составил 5,4 при 25 -С. Готовую среду
разливают в бутылочки по 100 и 200 куб. см. Стерилизуют при (121
+/- 1) -С в течение (15 +/- 1) мин.
7.18.3.2.2. Питательная среда М17
7.18.3.2.2.1. Основная среда
Состав:
- пептон 1 - 2,5 г;
- пептон 2 - 2,5 г;
- пептон 3 (перевар сои) - 5,0 г;
- дрожжевой экстракт - 2,5 г;
- мясной экстракт - 5,0 г;
- глицерофосфат (C H O PNa ) - 19,0 г;
3 7 6 2
- сернокислый магний (MgSCO х 7H O) - 0,25 г;
4 2
- аскорбиновая кислота - 0,5 г;
- агар - 9 - 18 г;
- дистиллированная вода - 950 куб. см.
Приготовление:
все компоненты растворяют в кипящей воде. Охлаждают до 50 -С.
Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации рН был в
пределах 7,1 - 7,2. Готовую среду разливают в бутылочки по 95 куб.
см. Стерилизуют при (121 +/- 1) -С в течение (15 +/- 1) мин.
7.18.3.2.2.2. Раствор лактозы
Состав:
- лактоза - 10 г;
- дистиллированная вода - 100 куб. см.
Приготовление:
лактозу растворяют в воде, стерилизуют при (121 +/- 1) -С в
течение (15 +/- 1) мин.
7.18.3.2.2.3. Полная среда
Состав:
- основная среда (7.18.3.2.2.1) - 95 куб. см;
- раствор лактозы (7.18.3.2.2.2) - 5 куб. см.
Приготовление:
непосредственно перед использованием расплавляют основную
среду в водяной бане и охлаждают до 48 - 50 -С. Подогревают
раствор лактозы до 48 - 50 -С. Добавляют раствор лактозы к
основной среде и перемешивают.
7.18.4. Подготовка образцов и проб
7.18.4.1. Перед вскрытием поверхность упаковки йогурта
обмывают, протирают, удаляя грязь, которая может загрязнить
йогурт. Затем поверхность протирают 70%-ным этиловым спиртом.
Упаковки с йогуртом вскрывают в условиях, приближенных к асептике.
7.18.4.1.1. Йогурт
Навеску йогурта массой (10 +/- 1) г помещают в стерильную
посуду и тщательно перемешивают с использованием стерильных
приспособлений или блендера.
7.18.4.1.2. Йогурт фруктовый (овощной)
Тщательно перемешивают все содержимое упаковки с йогуртом с
использованием блендера (измельчителя). Затем отбирают (10 +/- 1)
г образца для исследования.
7.18.4.2. Микроскопические исследования
Готовят микроскопический препарат йогурта, окрашивают
метиленовым голубым (например, спиртовым раствором метиленового
голубого - 6 г/куб. дм), затем просматривают несколько полей
зрения под микроскопом, чтобы определить соотношение двух
бактериальных видов (кокки и палочки) и выбрать разведения для их
количественного учета. Как правило, для подсчета палочек
используют пятое или шестое разведение, для подсчета стрептококков
- седьмое или восьмое разведение.
7.18.4.3. Приготовление первого разведения
К пробе йогурта, приготовленной в соответствии с 7.18.4.1.1
или 7.18.4.1.2, добавляют раствор (7.18.3.1), пока общий объем не
достигнет 50 куб. см. Перемешивают на блендере в течение 1 мин.
Затем добавляют раствор (7.18.3.1), пока общий объем не достигнет
100 куб. см. Таким образом, получают первое разведение.
7.18.4.4. Приготовление десятикратных разведений
В пробирку с 9 куб. см раствора пептонов (7.18.3.1) вносят 1
куб. см первого разведения йогурта. Смесь тщательно перемешивают в
течение 10 с. Таким образом, получают второе разведение. Повторяют
эту операцию до получения серии требуемых разведений.
7.18.4.5. Посев и инкубация
7.18.4.5.1. Для определения количества L. bulgaricus и S.
thermophilus засевают по 1 куб. см каждого разведения в две чашки
Петри для определения каждого вида микроорганизмов.
7.18.4.5.2. При определении L. bulgaricus в каждую чашку Петри
наливают по 12 - 15 куб. см расплавленной подкисленной среды MRS
(7.18.3.2.1) температурой (45 +/- 1) -С.
7.18.4.5.3. При определении S. thermophilus в каждую чашку
Петри наливают по 12 - 15 куб. см расплавленной среды М17
(7.18.3.2.2) температурой (45 +/- 1) -С.
7.18.4.5.4. Тщательно перемешивают содержимое чашек Петри
немедленно после внесения в них питательной среды и затем
оставляют для застывания среды чашки на горизонтальной холодной
поверхности.
7.18.4.5.5. Затем чашки переворачивают донышком вверх и
складывают одну на другую (не более 6 штук), и ставят в термостат.
7.18.4.5.6. Чашки Петри для подсчета L. bulgaricus
термостатируют при (37 +/- 1) -С в течение 72 ч в анаэробных
условиях.
7.18.4.5.7. Чашки Петри для подсчета S. thermophilus
термостатируют при (37 +/- 1) -С в течение 48 ч.
7.18.4.6. Подсчет колоний
После инкубации подсчитывают количество характерных колоний на
каждой чашке Петри. Для подсчета используют чашки, на которых
выросло от 10 до 300 колоний.
Чашки просматривают в проходящем свете. Для ускорения подсчета
может быть использовано специальное оборудование для подсчета
колоний.
7.18.4.7. Подтверждение
Выбирают колонии, которые использовались при подсчете, и
готовят микроскопический препарат, окрашивают по Граму. На среде
MRS должны вырастать грамположительные, неспорообразующие
каталазоотрицательные палочки, а на среде М17 - грамположительные
каталазоотрицательные цепочки кокков или диплококки.
7.18.4.8. Обработка результатов
7.18.4.8.1. Количество каждого вида микроорганизмов N (КОЕ/г)
определяют по формуле:
С
N = --------------, (1)
(n + 0,1n ) d
1 2
где:
С - сумма колоний L. bulgaricus или L. thermophilus,
подсчитанных по 7.18.4.6 на соответствующих чашках;
n - количество чашек, соответствующих L. bulgaricus или L.
1
thermophilus, подсчитанных в самом низком разведении;
n - количество чашек, соответствующих L. bulgaricus или L.
2
thermophilus, подсчитанных в самом высоком разведении;
d - число, соответствующее значению разведения для каждого
вида микроорганизмов, из которого был произведен первый подсчет.
7.18.4.8.2. Общее количество молочнокислых бактерий (КОЕ/г) в
йогурте определяют путем суммирования количества L. bulgaricus
(КОЕ/г) и L. thermophilus (КОЕ/г).
7.18.4.8.3. Пример подсчета
При подсчете L. bulgaricus на чашках Петри были получены
следующие результаты:
-5
10 разведение - 295 и 245 колоний;
-6
10 разведение - 33 и 40 колоний,
следовательно:
С
1 295 + 245 + 33 + 40 613 -5
N = -------------- = -------------------- = ---------- = 278 х 10 .
1 (n + 0,1n ) d -5 -5
1 2 (2 + 0,1 х 2) х 10 2,2 х 10
При подсчете S. thermophilus на чашках Петри были получены
следующие результаты:
-5
10 разведение - 280 и 240 колоний;
-6
10 разведение - 30 и 38 колоний,
следовательно:
С
2 280 + 240 + 30 + 38 588 -6
N = -------------- = -------------------- = ---------- = 204 х 10 .
2 (n + 0,1n ) d -6 -6
1 2 (2 + 0,1 х 2) х 10 2,2 х 10
Общее количество молочнокислых бактерий равно:
5 6 6
N = N + N = 278 х 10 + 204 х 10 = 231,8 х 10 , КОЕ/г.
1 2
7.19. Метод определения бифидобактерий (Bifidobacterium) в
биойогурте (посев на твердые среды)
Метод основан на высеве определенного количества продукта и
(или) его разведений в агаризованные селективные питательные
среды, культивировании посевов при оптимальных условиях, учете
результатов по характерным признакам и, при необходимости,
определении морфологических свойств обнаруженных микроорганизмов и
их подсчете.
7.19.1. Отбор и подготовка проб
7.19.1.1. Отбор проб биойогурта и подготовка его к анализу -
по ГОСТ 9225 и 7.17.4.1 настоящего стандарта.
7.19.2. Средства измерения, аппаратура, материалы и реактивы
7.19.2.1. Для проведения испытания применяют аппаратуру,
материалы и реактивы по ГОСТ 9225, а также дополнительно:
- микроанаэростат или эксикатор, или емкость с герметично
закрывающейся крышкой;
- анаэробный агент: анаэробная система AN 25 - supplier-OXOID;
- система для стерилизации фильтрацией фирмы Sartorius или
аналогичные системы других фирм (0,45 мкм);
- диклоксациллин Sigma D 9016;
- питательная среда MRS, закупаемая по импорту;
- кукурузно-лактозная среда (ГМК-1) для количественного учета
микроорганизмов по [8].
7.19.3. Подготовка к испытанию
7.19.3.1. Растворы для приготовления разведений готовят в
соответствии с ГОСТ 9225 и 7.18.3.1 настоящего стандарта.
7.19.3.2. Питательные среды
7.19.3.2.1. Питательная среда MRS с диклоксациллином
7.19.3.2.1.1. Состав питательной среды MRS:
- пептон - 10 г;
- мясной экстракт - 10 г;
- дрожжевой экстракт - 5 г;
- глюкоза - 20 г;
- твин 80 - 1 куб. см;
- фосфат калия однозамещенный - 2 г;
- ацетат натрия тригидрат - 5 г;
- диаммоний цитрат - 2 г;
- сернокислый магний (MgSO х 7H O) - 0,2 г;
4 2
- сернокислый марганец (Mn SO х 4H O) - 0,5 г;
2 4 2
- агар - 15 г;
- дистиллированная вода - 1000 куб. см.
7.19.3.2.1.2. Приготовление раствора селективного агента
Состав:
- диклоксациллин - 25 мг Sigma D 9016;
- дистиллированная вода - 50 куб. см.
Диклоксациллин растворяют в дистиллированной воде, затем
полученный раствор стерилизуют фильтрацией, срок хранения раствора
- 15 сут. при 4 -С.
В момент использования готовят разведение этого раствора 1:10.
7.19.3.2.1.3. Приготовление антиоксидантного раствора
Состав:
L-цистеин гидрохлорид - 3 г Sigma С 7880;
дистиллированная вода - 100 куб. см.
Растворяют хлористый цистеин в дистиллированной воде, затем
полученный раствор стерилизуют фильтрацией. Раствор разливают по
10 куб. см в стерильные пробирки. Хранят 15 сут. при 4 -С.
Приготовление питательной среды:
вносят 15 г агара в колбу с 500 куб. см дистиллированной воды,
которую помещают в кипящую водяную баню до полного растворения
агара. Вносят 55 г сухой среды MRS в другую колбу с 500 куб. см
дистиллированной воды температурой 50 -С. Смешивают оба раствора и