Объединенный Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (1970) для первичного выделения и для дальнейших пересевов культур бруцелл рекомендует такие основные среды: сывороточно-декстрозный агар; картофельный агар плюс сыворотка; триптикозно-соевый и триптозный агар; кровяной агар (5% овечьей крови в агаре основной среды).
Для выделения культур бруцелл из загрязненных посторонней микрофлорой материалов рекомендуется пользоваться этими же средами после добавления к ним не мешающих росту бруцелл антибиотиков: полимиксина, бацитрацина, циклогексамида, актидиона.
Изготовленная питательная среда может быть признана пригодной только в том случае, если на ней наблюдается рост большинства штаммов бруцелл при малом (5-10 микробных клеток) инокуляте.
Некоторые исследователи изучали потребность бруцелл в источнике азота и дополнительных факторах роста. О.В. Кондратьева и В.М. Степанов (1968, 1969) сделали вывод, что рост бруцелл обеспечивается при наличии в среде только 6 аминокислот: глютаминовой, L-аланина, лизина, метионина, гистидина, цистеина. Важнейшим источником азота, по их мнению, являются глютаминовая кислота и цистеин. Подчеркивается также потребность бруцелл в комплексе витаминов группы В (В1 В2, В6) и в никотиновой кислоте. Витамин А необходим для роста только некоторых штаммов бруцелл.
Для бруцелл характерен замедленный рост, особенно первых генераций культуры. Поэтому посевы материалов, взятых от естественно зараженных животных, следует выдерживать в термостате до 4-5 недель, если не получен рост в более ранние сроки. На хорошо подобранной среде лабораторные штаммы бруцелл дают обильный рост через 24-48 часов.
При посеве бруцелл из густой взвеси бактерий на скошенный агар образуется нежный с маслянистым блеском прозрачный слой, который постепенно грубеет, мутнеет, становится менее прозрачным и приобретает серый с голубоватым оттенком цвет. Почти такие же изменения наблюдаются при посеве бруцелл штрихом.
В посевах на бульон наблюдается постепенное равномерное помутнение среды. При длительном пребывании бульонной культуры в термостате на дне сосуда образуется рыхлый осадок, а на поверхности среды медленно образуется пристеночное кольцо или кольцо и пленка.
При разреженном посеве на агаровые пластинки в чашках Петри бруцеллы обычно растут в виде круглых, выпуклых, слегка прозрачных колоний с ровным краем. Поверхность колоний гладкая, с маслянистым блеском. При удлинении периода роста колонии становятся менее прозрачными.
Неnrу (1933), Нuddleson (1952), Раrnas и Сhodkowski (1959), П.Н. Жованик (1972) изучали колонии бруцелл под микроскопом при боковом освещении (техника этого исследования приводится в главе "Изменчивость бруцелл"). При этом освещении удалось обнаружить, что культуры бруцелл нередко бывают неоднородными (гетерогенными) по составу клеток. Клетки S-формы образуют круглые выпуклые колонии с ровными краями. При боковом освещении они имеют гладкую или нежно-зернистую поверхность и серо-голубое с зеленым оттенком свечение. На этом фоне выделяется небольшой красновато-желтый центр колонии. Спонтанно возникающие в процессе популяционной изменчивости клетки R-, М - или иной формы образуют колонии, которые резко отличаются от колоний S-формы, особенно по характеру свечения.
Культуры бруцелл хорошо сохраняются на твердых питательных средах при пересеве их через каждые 30-45 дней. Лучше хранить эти культуры в высушенном виде. При высушивании используют среду, содержащую 1,5% желатины и 10% сахарозы, растворенных в дистиллированной воде. Хранят высушенную культуру в хорошо запаянных ампулах без доступа воздуха при температуре 7°.
Патогенность и вирулентность бруцелл.
В организме зараженных животных бруцеллы живут и размножаются главным образом внутри клеток ретикуло-эндотелиальной системы. Это дает основание относить их к числу внутриклеточных паразитов, хотя иногда они могут находиться и внеклеточно. Проникнув в организм животного, бруцеллы обычно задерживаются в лимфоидных тканях и обуславливают развитие патоморфологических изменений в виде ретикуло-эндотелиальных пролифератов и некробиотических очагов. Эти патологические изменения зависят от степени вирулентности данной культуры.
Вирулентность каждого штамма культуры бруцелл является его индивидуальным свойством и в известной мере количественным выражением патогенности. Ее измеряют обычно величиной минимальной инфицирующей дозы (ИД), способной вызвать заражение всех или большинства опытных животных.
Как среди лабораторных, так и среди свежевыделенных культур бруцелл могут встречаться штаммы с весьма различной степенью вирулентности. В опытах на морских свинках высоковирулентные штаммы всех трех классических видов бруцелл вызывают развитие генерализованной инфекции уже в дозе 5-10 микробных тел (м. т.). По данным многих авторов и результатам наших собственных исследований, развитие генерализованной инфекции после такого заражения наступает обычно в течение 4-5 недель.
Для многих вирулентных штаммов бруцелл одна ИД составляет 25-50 м. т., а иногда и больше. Существуют слабовирулентные и авирулентные штаммы бруцелл. Культуры таких штаммов плохо приживаются в организме животных.
Исследователи определяли минимальную инфицирующую дозу бруцелл и в опытах на сельскохозяйственных животных. Нuddleson (1943) приводит результаты опытов Мак Ивена с соавторами и Хатчинга, в которых исследователи подвергли конъюнктивальному заражению осемененных телок разными дозами культуры Вr. abortus.
Хаддлсон подчеркивает, что для коров средней чувствительности минимальная инфицирующая доза культуры Вr. abortus составляла около 1 миллиона бактерий (м. т.) и что в опытах Хатчинга значительно меньшая доза и в более короткий срок вызывала появление первого доказательства инфекции в виде положительной реакции агглютинации. При подкожном заражении овец высоковирулентной культурой Вr. abortus доза 5-25 тыс. бруцелл вызывала лишь регионарную инфекцию (П.А. Вершилова, 1961). Развитие генерализованной инфекции регулярно получали после введения такой культуры в дозе 100 тыс. микробных клеток. При нанесении культуры на конъюнктиву или слизистую влагалища в дозе не менее 1-500 миллионов бруцелл наблюдали регулярное заражение овец.
У бруцелл нередко наблюдается спонтанное понижение вирулентности. Это может быть связано с популяционной изменчивостью культуры. Появляющиеся в культуре штамма измененные клетки вследствие свойственному им селективному преимуществу постепенно увеличиваются в количестве и начинают преобладать в популяции клеток, придавая культуре новые измененные свойства. Ослабленную вирулентность можно вновь повысить. Для этого, используя действие закона естественного отбора, культуры подвергают многократным пассажам через организм высокочувствительных к бруцеллезу морских свинок или каких-либо других чувствительных к бруцеллезной инфекции животных.
В сравнимых условиях опыта на морских свинках сопоставляли Вr. abortus и Вr. melitensis (П.Ф. Здродовский и П.В. Воскресенский, 1930), а также Br. Abortus и Вr. suis (Харди и др., 1931) с целью обнаружения различий в патогенности у разных видов бруцелл. Результаты исследований были противоречивы, поэтому выделить тот или иной вид бруцелл, как наиболее патогенный для морских свинок, не представилось возможным.
Делались попытки по оценке вирулентности бруцелл на основе их ферментативной активности и особенностей обмена веществ. Нuddleson (1943), изучив у всех трех классических видов бруцелл активность фермента каталазы, полагал, что высокой степени вирулентности соответствует более высокая каталазная активность штамма. Е.А. Драновская (1968) отмечает, что слабовирулентные штаммы Br. abortus и Вr. melitensis отличались от вирулентных штаммов более высокой активностью некоторых дегидрогеназных систем, участвующих в энергетическом обмене.
Антигенная структура бруцелл.
Естественное заражение бруцеллезом, как и искусственное введение культуры бруцелл, обычно сопровождается образованием в организме животного специфических антител. Это явление давно используется для диагностики болезни и серологической дифференциации различных видов и типов бруцелл.
Еще в 1932 г. Wilson и Miles установили, что клетки всех трех классических видов бруцелл, находящихся в обычной для них гладкой S-форме, содержат два серологически отличимых антигена А и М и что каждый из этих антигенов у различных видов бруцелл содержится в неодинаковом количестве. Несколько позже Мiles (1939) уточнил, что у Br. melitensis количественное соотношение между антигенами А и М может быть выражено примерно как отношение 1: 20, а у Вr. abortus и Вr. suis - как 20:
1. Это открытие дало основание для использования адсорбированных сывороток при отнесении исследуемой культуры бруцелл либо к виду Br. melitensis, либо в группу двух других видов. Клетки Br. suis имеют несколько большее количество антигена М, чем клетки Br. abortus. Но эта разница не столь значительна, чтобы ею можно было воспользоваться для серологической дифференциации этих видов бруцелл. Впоследствии накапливалось все больше фактов, которые свидетельствовали, что существенные количественные различия в содержании А и М антигенов наблюдается не только в культурах, принадлежащих к разным видам, но и у разных штаммов одного и того же вида. Все более частые случаи выявления серологических вариантов внутри того или иного вида бруцелл значительно затрудняли использование метода абсорбции агглютининов для целей межвидовой серологической дифференциации этих бактерий. Результат такой дифференциации был очень условным и относительным (П.Ф. Здродовский, 1953). В конце концов все это привело к признанию, что дифференциация бруцелл по РА с моноспецифической сывороткой имеет значение в основном только при идентификации биотипов внутри каждого из трех классических видов бруцелл.