Существует несколько способов хранения эмбрионов: кратковременное вне организма, кратковременное в организме, долговременное в сжиженных газах.
При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов вне организма был использован опыт культивирования тканей и клеток. Наиболее подходящей средой оказалась ТСМ 199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки крови оленей. Эмбрионы хранят в атмосфере обогащенной углекислым газом, при постоянной температуре 37 градусов. В таких условиях они остаются жизнеспособными 24–48 ч. Имеются сообщения о том, что снижение температуры до 10 градусов позволяет продлить их жизнеспособность до 5–6 суток.
На протяжении 3–4 суток эмбрионы можно хранить в яйцепроводах крольчих, выживаемость составляет в средне 73%. В настоящее время этот способ не применяется.
На сегодня известно 2 способа глубокого замораживания эмбрионов: в программируемом режиме (ступенчатое замораживание); одномоментный (витрификация).
При замораживании по первому способу отобранные эмбрионы (отличного и хорошего качества) последовательно проводят через растворы криопротектера (глицерин или диметилсульфоксид) возрастающих концентраций, приготовленные на фосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки. После этого эмбрионы переносят в пробирки или ампулы (по 1–4 в каждую) вместе с 0,3 – 0,4 мл среды с криопротектором. Емкости с эмбрионами герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают) и помещают в камеры замораживателя, где охлаждают до -7 градусов в режиме 1 градус в минуту. После достижения указанной температуры вызывают кристаллизацию среды. Для этого в жидком азоте пинцетом касаются стенки пробирки(ампулы) в зоне верхнего края столбика среды. Дальнейшее охлаждение (до -28 градусов или -35) ведут со скоростью 0,5 градуса в минуту, затем скорость уменьшают до 0,1 градус в минуту; через 10 минут доводят до конечной температуры погружением в жидкий азот.
Одномоментное замораживание (витрификация) – отвердение при чрезвычайно высокой вязкости среды, что ведет к образованию стекловидных структур. Это возможно при высокой концентрации криопротектора и быстром охлаждении.
Замораживают быстрым методом в минипайетах емкостью 0,25 мл в пайету, последовательно засасывают 0,5 М раствор сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствор сахарозы. Концы закрывают с обеих сторон пластиковыми пробками. После эквилибрации пайету, содержащую эмбрион, выдерживают 5 мин в парах жидкого азота, затем опускают в сосуд с жидким азотом (Н.И. Полянцев, 2001).
Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.
Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами.
При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50–55%. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов составит 55–60%.
По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. После герметизации емкости с эмбрионами ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10–12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.
Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.
Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего переживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.
Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет (И.Р. Чернева, 2007).
Заключение
Разведение крупного рогатого скота молочных пород с помощью
трансплантации эмбрионов позволяет: обеспечить размножение
высокоценных племенных быков-производителей; формировать поголовье
заводских семейств; усилить давление по отбору быков-производителей,
дочерей – трансплантантов, повысить генетический тренд по селекционным
признакам.
Сравнение молочной продуктивности дочерей быков – трансплантантов и их сверстников, полученных путем искусственного
осеменения показало, что удой первых оказался более
высоким по сравнению с дочерьми быков от искусственного осеменения.
Применение метода трансплантации эмбрионов в заводских
семействах от высокоценных коров-доноров сокращает сроки их
формирования в 1,5 раза по сравнению с искусственным осеменением за счет
получения большего числа потомков.
Применение элементов системы МОЭТ дает возможность
увеличения численности полученных путем трансплантации высокоценных
ремонтных быков за одинаковые воспроизводительные циклы
быко – воспроизводящих коров и увеличить число быков, получающих
племенные категории после проверки по качеству потомства в 4 раза. В
закрытом нуклеусном стаде сокращается срок воспроизведения животных
через лучшую его часть поголовья почти в 3 раза.
Расчет затрат на получение одного высокоценного ремонтного быка
методом трансплантации из отечественных эмбрионов показал, что они в 2,2
раза больше по сравнению с расходами на искусственное осеменение, но
меньше в 5,4 раза, чем на покупку быка из-за рубежа и в 3,5 раза, чем на приобретение эмбрионов за пределами страны (И.Р. Чернева, 2007).
Список литературы
1. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. – Л.: «Агропромиздат», 1999.
2. Полянцев Н.И., Подберезный В.В. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных. Ростов н/Д.: Феникс, 2001. – 480 с.
3. Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. – Л.: «Наука», 1998.
4. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я. Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения. – 7-е изд., перераб. и доп. – М.: Колос, 1999. – 495 с.
5. Чернева И.Р. Лекции по биотехнологии и пересадке эмбрионов. Московская ветеринарная академия им. Скрябина, 2007.