Селекция при помощи маркеров (стр. 4 из 5)

Находим аналогию (математическую корреляцию) между какими либо длинами отрезков и аллелями интересующего нас гена. Надеюсь, что понятно объяснил, в противном случае спрашивайте напрямую, писать не мой конёк.

Наша троица не может воспользоваться и этим методом, потому, что установить какие длины фрагментов соответствуют каким аллелям, интересующих нас, генов мы не можем. У нас очень мало материала (мало разнообразия) для статистической обработки.

Следующий родившийся метод это прямое определение полной нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК – сиквинирование. Метод очень точный, если конечно применять современный сиквинатор, но долгий и прибор очень дорогой. Нам необходимо изначально знать точные последовательности нуклеотидов в различных аллелях генов или некодирующих последовательностей, сцепленные с аллелизмом какого-нибудь признака. Зная это, мы берём пробу ДНК у животного и сиквенируем её, не правда ли просто в двух словах!? Но на самом деле сиквенирование – это гениально сложный, в техническом исполнении, процесс, основанный на гениально простом принципе. В настоящее время известные последовательности ДНК многих генов можно узнать в интернете при помощи программы BLAST, многого я о ней не расскажу, но подведу к тому, что BLAST пользуется электронной библиотекой сиквенсов генов, о них моя следующая справка:

Справка: Появление глобальной сети «интернет» облегчила жизнь большинству исследователей (не будем трогать учёных таких стран как Северная Корея, им ничуть не облегчила), теперь они имею возможность быстро и дёшево общаться между собой и проводить научные работы совместно, иногда даже будучи незнакомыми людьми. Создание электронных библиотек генов в интернете – это, на мой взгляд, яркий тому пример. Электронная библиотека содержит в себе сиквенсы различных генов существ нашей планеты, и она постоянно пополняется новым материалом. Если бы я, например, занимался генетикой клопа, а именно его устойчивостью к ионизирующим излучениям, и мне удалось бы выделить ген, отвечающий за белок, который определяет эту устойчивость. То я бы, во первых стал миллионером, а во вторых отсиквенировал бы этот ген, кодирующий этот белок, и запустил бы сиквенс в электронную библиотеку под именем «Родоназа клопа» (может быть я бы его так назвал). Теперь всякий учёный, выделивший аналогичный ген, у какого-либо другого существа, в анонимном виде и отсиквенировавший его, запускает в BLAST свою последовательность и получает процент его аналогии с Родоназой клопа, всем хорошо, ну а мне лучше всех!

В настоящий момент в нашей стране (да и во многих других странах) существуют электронные библиотеки генетических маркеров. Возьмём для примера электронную библиотеку генетических маркеров в различных популяциях домашней свиньи (Sus skrofa domesticus) института цитологии и генетики СО РАН. Библиотека состоит из большого числа генетических и количественных признаков, представляющих первичную информацию. Это позволяет пользователю по своему усмотрению организовывать математическую обработку данных, строить и проверять новые модели и гипотезы. В настоящее время библиотека представлена отдельными базами данных по свиньям пород крупная белая, кемеровская, скороспелая мясная и семиреченская. Селекционно-генетическая информация представлена символьными (в случае генетических маркеров) и числовыми (для описания количественных признаков) полями. Формат баз данных позволяет проводить статистическую обработку стандартными методами в среде FoxPro.

Созданные базы данных позволяют проводить поиск и фильтрацию данных по конкретным параметрам (например, возможно составление подвыборок с заданным комплексным генотипом и оценка количественных признаков в определенных группах). Молекулярно-генетический сервер поддерживает различные функции, такие как прием и передача данных пользователю; поддержка пользовательских проектов; статистическая обработка; формирование запросов и получение данных из базы и т.д. Сами данные хранятся в объектно-реляционном представлении под управлением SQL сервера. Выходные результаты могут быть представлены в различном виде, который пользователь определяет при формировании запроса. Например, таблицы первичных данных, таблицы результатов статистической обработки, графики, диаграммы и т.д.[4] Авторство последних полутора абзацев принадлежит какому-то энтузиасту из авторов статьи «Электронные библиотеки – 1999 – Том 2 – Выпуск 3», я решил оставить этот кусок без изменения, на самом деле он нужен не только чтобы увеличить объём моей работы (а это имеет место быть), но и как современный пример работы с маркерами. Допустим мы имеем хряка (будущего производителя), которого на наш взгляд нужно оставить на племя. Мы оцениваем его при помощи определённого набора маркеров и вводим данные в анализирующую систему нашей библиотеки, она выдаёт, насколько этот хряк соответствует стандарту и чем он лучше или хуже уже имеющихся в библиотеке хряков. Если мы принимаем решение о случке нашего хряка с племенной свиноматкой, то достаточно дать компьютеру команду и система автоматически подберёт нам оптимальных свиноматок.

Самое главное, что я хотел донести в этой справке это то, что в случае с Сиквенированием и многими другими методами легче всего работать, уже зная конкретные маркеры, а вот не знать, и находить новые маркеры это уже совсем другая тема, вскользь я пытался объяснить про это в «Дополнении». Так вот наш продвинутый селекционер Серхио имеет доступ к электронным библиотекам генетических маркеров различных популяций коз и интернету (на дворе у нас уже 21 век, а наши чабаны всё со своей новой породой возятся, видимо ещё не клюнул). Так что же будут теперь делать наши молодцы и старик Джамбулат?

К прямому сиквенированию они также решили не прибегать (ещё в начале 80-х), чтобы не разориться и не влезать в долги. А поиски их продолжались и, к величайшей их радости, в 1983 году Кари Маллис, одиночный гений, произвёл революцию в научном мире, открыв полимеразно-цепную реакцию (ПЦР, по английский PCR). На базе ПЦР придумано множество методик для работы с ДНК в различных сферах науки и жизни. Огромное распространение они получили и в сельском хозяйстве, в частности в MAS. Возможностями некоторых новых методов и решили воспользоваться наши чабаны. Расскажу, для начала, про то какие же это методы, хотя бы про часть из них:

Не будем вдаваться в подробности о том, что же такое ПЦР и как она происходит, как говорит моя мама: «Это и ежу понятно!», хотя вопрос спорный, вряд ли эта информация как-то поможет ему лучше выжить. И снова к делу! Первый метод, о котором я хочу рассказать, чем-то напоминает мне ПДРФ, но только по видимым результатам, а называется он RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA). Метод заключается в том, что геномную ДНК, изучаемого объекта, амплифицируют с декануклеотидными, вырожденными праймерами (универсальными праймерами). Праймеры гибридизуються с комплементарными последовательностями на молекуле ДНК, эти комплементарные участки располагаются на молекуле в случайном порядке (не знаю насколько в данном случае уместно такое изречение, по крайней мере, эти праймеры иногда называют случайными). В процессе ПЦР амплифицируються участки, фланкированные этими праймерами. Потом ПЦР-продукт разгоняется на электрофорезе, и мы видим картинку, можем сверить её с «форезом» другого животного. Чем-то напоминает ПДРФ, не правда ли? Расположение, комплементарных праймерам, последовательностей имеет видовые различия, а также может иметь и внутривидовые различия, и наследуется по законам Менделя. При помощи RAPD-PCR можно устанавливать происхождение чёрной икры (пример взят из книги «ДНК технологии в развитии агробиологии»), а можно (наверное) связать полиморфизм ПЦР-продуктов с аллелями каких-либо генов, как при ПДРФ (моё личное предположение).

Зная нуклеотидную последовательность интересующего нас гена, можно подобрать специфичные ему праймеры. Как правило, минимум 18-ти нуклеотидные (в некоторых источниках минимум 17-ти нуклеотидные), и амплифицировать сам интересующий нас ген. Таким образом, мы можем идентифицировать наличие или отсутствие гена устойчивости к заболеваниям, устанавливать пол у животных на любой стадии развития, в случае если это затруднено, определять наличие инфекционных возбудителей во внутренне среде организма, вирусных инфекций и т.д. Существует множество вариантов ПЦР: это и якорная ПЦР, и гнездовая, и инвертированная ПЦР и т.д. Имеются, также, и совмещённые методы анализа, такие как ПЦР-ПДРФ,

ПЦР-ПДРФ – метод, при котором продукт амплификации подвергают рестрикции и разгоняют на электрофорезе (часто на полиакриламидном геле, так как он обладает большей разрешающей способностью). В данном случае все используемые принципы мной уже описаны, амплифицируемый фрагмент ДНК проверяется на наличие точковых мутаций, приводящих к появлению или исчезновению в нём сайтов рестрикции. Используя этот метод можно распознавать аллелизм исследуемого гена и определить его гомозиготность или гетерозиготность (если, конечно, это эукариот). Опять же говоря метод, даёт результат не во всех случаях. У этого метода имеются модификации, но подробно говорить о них не будем, причины я объясню ниже.