Успехи геномики (и генной инженерии) позволяют выявлять гены, необходимые патогену при его размножении только в инфицированном организме и вести затем поиск ингибиторов функций их продуктов. Так, с недавнего времени получила известность система "InVivo Expression Technology" (IVET), используемая для отбора генов вирулентности (ivi гены) [7,8].
Геном исследуемого патогена фрагментируется с помощью набора рестриктаз: в отдельных фрагментах оказываются или ivi гены, или "жизненно важные" гены. Последние необходимы клетке для ее роста и invivo, и invitro.
Ингибиторы их функций могут быть выявлены и на искусственной питательной среде, то есть известными путями. Гены же вирулентности, мало изученные вообще, представляют, как мишени для химиотерапевтического агента, особый интерес, поскольку патоген, потерявший вирулентность, будет быстро уничтожаться защитными силами организма.
Система IVET, основанная на захвате промотора тех генов, которые экспрессируются только invivo, позволила обнаружить, например, у сальмонелл примерно 1% таких генов. Системы обнаружения ivi генов, основанные на разных подходах, разрабатываются в разных лабораториях. В число генов вирулентности входят не только гены, кодирующие образование адгезинов, инвазинов и т. п., но и гены, позволяющие микроорганизму переносить дефицит необходимых веществ в макроорганизме, например, гены системы транспорта железа, реутилизации пуринов.
Несомненно, что на парадигмах современной химиотерапии, а точнее – химиотерапии ближайшего будущего должно сказаться развитие протеомики [9,10,11].
Протеомика в обязательном сочетании с молекулярной биологией, геномикой и белковой химией знаменует качественно новое углубление знаний во всех областях биологии, в том числе и микробиологии. Как правило, в статьях, посвященных вопросам протеомики, подчеркивается, что ее развитие становится возможным. Более того, оно неизбежно именно в "постгеномную" эру.
Если геномика основана на дифференциации каждого гена из их совокупности в геноме и его характеристике в разных аспектах с использованием баз данных, то протеомика – на дифференциации и характеристике клеточных белков также с использованием баз данных.
Протеомика, говоря с некоторой долей условности, ближе к познанию фенотипа клетки, выращиваемой в конкретных условиях или находящейся под воздействием тех или иных стрессовых факторов. Обнаружение гена само по себе еще не означает, что он экспрессируется в любом случае, то есть что его продукт должен приниматься во внимание всегда. В то же время обнаружение кодируемого геном продукта и определение его количества, как правило, должно учитываться при характеристике свойств клетки.
Стандартный анализ протеома начинается с извлечения растворимых белков и их разделения и визуализации методом двумерного электрофореза в геле. Индивидуальный белок после предварительной обработки анализируется методами масс-спектрометрии или другими методами (капиллярная жидкостная хроматография). Идентификация белков осуществляется с использованием опять-таки соответствующих баз данных.
Такая методология позволяет уловить ответ клетки по качественным и количественным изменениям белковой экспрессии на всевозможные внешние воздействия, включая реакцию на добавленный антибиотик, на факторы иммунитета; улавливаются также по характеру белковой экспрессии изменения, ведущие к патогенности, антибиотикорезистентности и т.д.
Одна из важных задач протеомики – контроль за посттрансляционными модификациями белков. С помощью баз данных привлекшие к себе внимание белки классифицируются по функциям, внутриклеточной локализации и другим показателям, характеризующим их роль.
Техника двумерного электрофореза требует, однако, в ряде случаев усовершенствования. Например, ведется поиск особых приемов для улучшения идентификации гидрофобных (связанных с мембранными структурами) белков.
Актуальным является уменьшение трудоемкости анализа совокупности белков микробной клетки, поскольку в ней насчитывается несколько тысяч индивидуальных белков. Тем не менее уже достигнута идентификация в одном эксперименте около 2000 белков.
В последнее время стала развиваться количественная протеомика, позволяющая количественно сопоставлять экспрессию отдельных белков. В целом протеомика не только дополняет геномику, ее направление, которое получило название "метаболической" или "функциональной", но и является этапом (не последним) приближения к пониманию клетки как единой динамичной совокупности макромолекулярных структур.
Возможно, что в будущем предстоит терминологическое оформление и "постпротеомной" эры, когда предметом внимания окажется состав и количественное соотношение (на данный момент ростового цикла) всех низкомолекулярных метаболитов – продуктов ферментативных реакций. Учитывая, что реалии химиотерапии очень часто базируются на препаратах, являющихся аналогами ферментных субстратов, можно также ожидать принципиального вклада в химиотерапию будущего.
Интересно отметить, что основополагающие факторы, касающиеся механизма действия пенициллина, как потом оказалось, применимые и к другим b-лактамным антибиотикам, были получены более чем за треть века до формирования протеомики именно в соответствии с методологией этой, неизвестной тогда, научной дисциплины. В тот период, когда было установлено, что пенициллин, являясь ингибитором D-аланинтранспептидазы, прекращает образование пептидогликана клеточной стенки у бактерий, и когда внимание сосредоточилось на пенициллине как аналоге субстрата в активном центре этого фермента, совершенно неожиданно возник новый, как будто бы излишний, термин – "пенициллинсвязывающие белки".
Методами электрофореза (в сочетании с радиоизотопными) была показана необходимость учета топографии всей микробной клетки при установлении механизма действия b-лактамов. Множественность D-аланинтранспептидаз, одинаковых по каталитической функции, но не по молекулярной массе и другим физико-химическим свойствам, отвечающих за завершение синтеза пептидогликана на полюсах клетки, или при формировании клеточной перегородки, или при удлинении палочковидных форм, оказалась крайне важной. Они обладали неодинаковым сродством к разным b-лактамам. В конечном счете это сыграло определяющую роль в том, что b-лактамы стали наибольшей по разнообразию и значимости группой антибиотиков.
Роль протеомики в химиотерапии в будущем может быть связана с решением многих проблем, стоящих перед наукой. В качестве примера следует указать на назревшую необходимость изучения методами протеомики клеток Helicobacter pylori при микроэволюции этого патогена в инфицированном организме [12].
Известно, что культура H.pylori при стрессовой ситуации invivo дифференцируется как бы на две субпопуляции – одна часть клеток гибнет и лизируется, другая же часть адаптируется и поглощает ДНК, освободившуюся из лизировавшихся клеток. Предполагается, что общий сигнал для популяции – "quorum santis" – обеспечивает выживание культуры в трудных условиях за счет обогащения генома компетентных клеток. Однако для того чтобы подтвердить биологическое значение этого явления требуется изучить экспрессию поглощенных генов, используя методы протеомики, в частности количественной.
Широкое использование подходов со стороны не только геномики, но и протеомики необходимо для выяснения причин современной эпидемии туберкулеза. Это относится как к характеристике протеома клеток микобактерий, например, доказательство реальности компенсаторных мутаций и изучение их фенотипического выражения, так и к проблеме гетерогенности человеческой популяции в отношении восприимчивости к туберкулезу [13].
Число таких приложений методологии протеомики непосредственно к решению задач химиотерапии велико. Целесообразно тем не менее упомянуть о протеомике применительно к биогенезу вторичных метаболитов с антибиотическими свойствами у актиномицетов. Проблема экспрессии "молчащих" генов, включенных в биогенез антибиотических структур, может быть очень важна для пополнения перечня природных химиотерапевтических веществ.
Напрашивается возможность сопоставления генов, экспрессия которых играет роль в приспособлении патогенного микроорганизма к действию неблагоприятных факторов invivo, и в приспособлении почвенного микроорганизма к меняющейся внешней среде.
Проблема становится, таким образом, общебиологической. Прикладные же цели здесь разные: поиск генов, то есть их белковых продуктов как новых мишеней для химиотерапевтических веществ, и поиск генов, то есть кодируемых ими ферментов, включенных в биогенез еще не описанных химиотерапевтических агентов.
Как следует из всего изложенного, ведущую роль в каждом новом направлении, от которого ожидается прогресс антимикробной химиотерапии, играют не микробиологи. В одном случае – это химики-органики и биоорганики, в другом – генетики, в частности генные инженеры, в третьем – специалисты по белковой химии и биохимики. Используя методологию комбинаторной химии, геномики и протеомики, они с полным основанием указывают на реальность новых подходов к получению антимикробных агентов.
И все же самая блестящая разработка теоретических основ этих подходов еще не означает непосредственного вклада в практику. Последний может задержаться из-за недостаточного внимания к особенностям микробной клетки в целом и особенностям конкретного патологического процесса.
Образно говоря, намерения фундаментальных наук декларированы, а мощь их методологии продемонстрирована. Настала очередь существенного практического вклада в решение актуальных проблем химиотерапии.
Как своего рода образец для сравнения поисковых стратегий, разделенных полувековым периодом, и в связи с недавно отмеченным 50-летним "юбилеем цефалоспоринов" небезынтересно вернуться к истории открытия цефалоспоринаС [14,15]. Она является примером самоотверженного труда без далекоидущих теоретических построений: в то же время цефалоспорины четырех поколений являются полусинтетическими вариантами этого цефалоспорина. Его открытие – цепь случайностей и счастливого выбора правильного направления исследований.