Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОКСОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................3
ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................4
ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................5
СТРОЕНИЕИММУНОГЛОБУЛИНОВ...................................................................................5
ГЕНОМНАЯОРГАНИЗАЦИЯИ ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВL-ЦЕПЕЙ ИГ УМЛЕКОПИТАЮЩИХ....................................................................7
ГЕНОМНАЯОРГАНИЗАЦИЯИ ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВL-ЦЕПЕЙ ИГ УНИЗШИХПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11
ЭВОЛЮЦИЯГЕНОВ L-ЦЕПЕЙИГ.......................................................................................19
МАТЕРИАЛЫИМЕТОДЫ...........................................................................................24
ЭЛЕКТРОФОРЕЗДНК............................................................................................................24
ВЫДЕЛЕНИЕДНК ИЗГЕЛЯ.................................................................................................24
ПОЛУЧЕНИЕРАДИОАКТИВНЫХЗОНДОВ......................................................................25
ВЫДЕЛЕНИЕПЛАЗМИДНОЙДНК......................................................................................26
ОЧИСТКАПЛАЗМИДНОЙДНК МЕТОДОМРАВНОВЕСНОГО
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯВ ГРАДИЕНТЕПЛОТНОСТИCsCl........................................26
ТРАНСФОРМАЦИЯПРОКАРИОТИЧЕСКИХКЛЕТОК...................................................27
ВЫДЕЛЕНИЕЛЕЙКОЦИТОВИЗ КРОВИРЫБ.................................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕСУММАРНОЙРНК ИЗЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙДНК
ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХКЛЕТОК.....................................................................................28
КОНСТРУИРОВАНИЕБИБЛИОТЕКИкДНК......................................................................29
ПОЛИМЕРАЗНАЯЦЕПНАЯРЕАКЦИЯ...............................................................................33
СУБКЛОНИРОВАНИЕДНК...................................................................................................34
СКРИНИНГБИБЛИОТЕКИкДНК........................................................................................34
ОПРЕДЕЛЕНИЕНУКЛЕОТИДНОЙПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИДНК.............................35
САУЗЕРНБЛОТГИБРИДИЗАЦИЯ.....................................................................................36
РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................................................38
КОНСТРУИРОВАНИЕБИБЛИОТЕКИкДНК И ЕЕСКРИНИНГ.....................................38
ОПРЕДЕЛЕНИЕПЕРВИЧНОЙСТРУКТУРЫ......................................................................40
СРАВНИТЕЛЬНЫЙАНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙСТРУКТУРЫ..............................................40
АНАЛИЗГЕНОМНОЙОРГАНИЗАЦИИ..............................................................................41
ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................................46
ВЫВОДЫ...............................................................................................................................48
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................49
СПИСОКСОКРАЩЕНИЙ
ИГ иммуноглобулины
пн пар нуклеотидов
тпн тысячпар нуклеотидов
е.а. единица активности
ИПТГ изопропилтиогалактозид
ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-диамин
трис трис(гидроксиметил)аминометан
дНTФ дезоксиаденозинтрифосфат
ддНТФ дидезоксинеклеотидтрифосфат
дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат
рATФ рибоаденозинтрифосфат
ДТТ дитиотрейтол
Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетатнатрия
SDS додецилсульфатнатрия
X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-галактозид
ВВЕДЕНИЕ
Воснове функционированиягуморальногоиммунитетау млекопитающихлежит сложныйкомплексмолекулярно-генетическихи физиологическихмеханизмов,обеспечивающихреорганизацию,мутагенези клональнуюэкспрессиюгенов иммуноглобулинов.Возникновениеэтой подсистемыиммунитетасвязывают споявлениемхрящевых рыб.
Наранних этапахэволюции геныИГ были организованыв виде повторяющихсякластеров V-J-Cгенных сегментов.При подобнойорганизацииразнообразиепродуцируемыхантител основывалось,прежде всего,на количествеимевшихсяв геноме кластеров,каждый из которыхкодировал одинвариант полипептидныхсубъединицИГ. В ходе дальнейшейэволюции произошелпереход откластернойк сегментарнойорганизации,обеспечивающейдополнительныйисточникразнообразияза счет комбинативнойрекомбинациигенных сегментов.Предполагается,что этот переходтакже имелважное значениедля регуляцииэкспрессиигенов и осуществлениямеханизмовклональногоотбора антителопродуцирующихклеток в ходеиммунногоответа.
Настоящаяработа представляетсобой частьпроекта, направленногона изучениеэволюции механизмовизотипическогоисключениягенов легкихцепей ИГ у низшихпозвоночных.Целями работыявлялись изучениеструктуры иорганизациигенов легкихцепей ИГ стерляди(Acipenser ruthenus), представителяфилогенетическидревней группыкостно-хрящевыхрыб.
ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Иммуноглобулинывыполняют ворганизмепозвоночныхфункцию гуморальныхантител иантиген-связывающихрецепторовВ-лимфоцитов.Особенностьюэтого классабелков являетсяогромноеразнообразие,позволяющееим вступатьво взаимодействиес фактическилюбыми биологическимимакромолекулами.
Типичнаямолекула ИГсостоит издвух идентичныхтяжелых (H) и двухидентичныхлегких (L) полипептидныхцепей. H- и L-цепипостроены изнесколькихдоменов, каждыйиз которыхсостоит примерноиз 110 аминокислотныхостатков. Умлекопитающихсуществуетпять классовH-цепей: g,m, a,d,и e.Каждая H-цепьпостроена изодного N-концевогои нескольких(трех или четырех)C-концевых доменов.N-концевые доменыразличаютсяв разных молекулахи называютсявариабельными(V) доменами.C-концевые доменыимеют одинаковуюструктуру умолекул одногокласса и называютсяконстантными(С) доменами(рис. 1) (Пол, 1987).
СредиL-цепей млекопитающихразличаютдва типа: лямбдаи каппа. КаждаяL-цепь состоитиз одноговариабельногои одного константногодоменов. Виндивидуальноймолекуле ИГприсутствуеттолько одинтип L-цепи (Roitt et al.,1993).
ГигантскоеразнообразиеИГ обеспечиваетсяпрежде всеготем, что V и C областикодируютсяразными генами(генными сегментами),физическиразнесеннымив зародышевойДНК.
Вформированиивариабельныхдоменов H-цепейучаствуюттри генныхсегмента:вариабельный(V), D-сегмент (отангл. diversity- разнообразие)и J-сегмент (отангл. joining- соединяющий).С-областиН-цепей разныхклассов кодируютсяотдельнымигенами (Roitt et al., 1993).
Рис.1. Схема строениямолекулыиммуноглобулина.
Типичнаямолекулаиммуноглобулинасодержит двеидентичныелегкие (L) и двеидентичныетяжелые (H) цепи,связанныемежду собойковалентнодисульфиднымисвязями. КаждаяL-цепь состоитиз одноговариабельного(VL)и одного константного(СL)домена. Н-цепьсостоит изодного VHи несколькихCНдоменов.
В формированиизрелого генаL-цепи участвуюттри генныхсегмента:V-сегмент иJ-сегмент кодируютV-домен, C-сегменткодирует константныйдомен. На позднихстадиях развитияВ-лимфоцитагенные сегменты,кодирующиевариабельныедомены, объединяютсяв различныхсочетаниях,образуя матрицудля экспрессииL- и H-цепей (Seidman et al.,1979; Durdik et al., 1984).
ГЕНОМНАЯОРГАНИЗАЦИЯИ ЭКСПРЕССИЯГЕНОВ L-ЦЕПЕЙИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Различныевиды млекопитающихимеют сходнуюсхему организациии экспрессиигенов ИГ. Однимиз наиболееизученныхв этом отношениивидов являетсячеловек. Лямбдаи каппа цепиИГ у человекакодируютсягенами, расположенымив разных локусахи на разныххромосомах.Каппа локуссостоит избольшого количестваVkгенных сегментов,собраных вгруппы, пятиJkи одного Сkсегмента..Такой типорганизацииназываетсясегментарным(рис. 2). Лямбдалокус состоитиз группы Vlсегментов,точное количествокоторых неизвестно,и семи пар Jl-Clсегментов.Три из них (JCl4- JCl6)являются псевдогенами(Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).
Впроцессе развитияВ-лимфоцитав кроветворныхорганах одиниз V сегментовсоединяетсяс одним из Jсегментовпосредствомсайтспецифическойрекомбинации(Schatz et al., 1992). В этотпроцесс вовлекаютсяспециальныеолигомерныепоследовательности:гепта- и нонамеры,фланкирующиес 3' стороны Vсегмент и с5' стороны J сегмент(рис. 3) (Aguilera et al., 1987; Hesse et al.,1989). Отличительнойособенностьюлямбда и каппалокусов являетсяконфигурацияпромежутковмежду гепта-и нонамерами,называемыхспейсерами.С V и J геннымисегментамилямбда типаассоциированы23 пн и 12 пн спейсерысоответственно,а с V и J сегментамикаппа типа -12 пн и 23 пн спейсеры(Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).
л 
Рис.2. Схема строениялямбда и каппалокусов геновL-цепей ИГ человека.
Лямбдалокус содержитмного Vlсегментови семь парблизкорасположенныхJl-Cl.Три из нихяляюся псевдогенами(Y).Каппа локуссодержит многоVkпять Jkи один Ckгенный сегмент(Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).
Обозначения: - сигнальныеолигомеры.
Рис.3. Схема расположенияолигонуклеотидныхпоследовательностей,задействованныхв сайтспецифическойрекомбинациив каппа локусемлекопитающих.Эти последовательностифланкируютс 3‘ стороныVLсегмент и с5’ стороны JLсегмент. Вовремя рекомбинациигептамер инонамер одногоиз VLсегментаобъединяютсяс гептамероми нонамеромодного из JLсегмента. Этоделает возможнымсоединениеVLи JLсегментовбез нарушениярамки трансляции(Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).
Обозначения: - сигнальныеолигомеры.Последовательность,в которойрекомбинируютлокусы L-цепей,строго упорядоченаво времени.Показано, чтопервыми перестраиваютсялокусы каппатипа, причемесли в однойхромосомеперестройкаоказаласьнефункциональной,тоесть не привелак появлениюполноценногогена, то рекомбинацияпроисходитв каппа локусена гомологичнойхромосоме. Вслучае повторнойабортивнойперестройкианалогичнопроисходятперестройкив лямбда локусах.Если в клеткенепродуктивноперестроилисьвсе четырелокуса, то онапревращатсяв 0-клетку иподвергаетсяапоптозу. Еслиже перестройкаодного из локусовпривела к образованиюфункциональногогена, то рекомбинацияостальныхлокусов блокируется.Детали механизмаблокированиянеизвестны,однако установлено,что необходимымусловием длянего являетсятранскрипцияпродуктивноперестроенногогена. В результатев каждом индивидуальномлимфоцитесинтезируетсятолько одинтип L-цепей, каппаили лямбда, иэкспрессиягена происходиттолько на однойиз двух гомологичныххромосом. Этифеномены,называемыеизотипическими аллельнымисключениямилежат в основеключевогопринципафункционированияиммуннойсистемы - принципаклональнойселекции (Пол,1987; Strob, 1987).
Ворганизмемлекопитающихгенерируетсясвыше десятимиллионоввариантовантител, хотяв геноме содержитсязначительноменьшее количествогенных сегментов,которые могутучаствоватьв формированиивариабельныхдоменов. В случаеL-цепей, основнымисточникомразнообразияявляется комбинативноесочетаниеV и J сегментов.Дополнительнымисточникомявляется смещениерекомбинационнойрамки в местеих соединения.Кроме того, Vгенные сегментымогут обмениватьсяучасткамиДНК с псевдогенамипосредствомгенной конверсии.Очень существенныйвклад в разнообразиеспецифичностейантител вноситсоматическоемутированиевариабельныхгенных сегментовв сайтах, участвующихв формированииантигенсвязывающегоцентра. Соматическоеразнообразиегенерируетсяпри вторичномиммунномответе путемвключениягипермутационногомеханизмав клетках памятив зародышевыхцентрах лимфатическихузлов (Tonegawa 1983; Roitt et al.,1993).
ГЕНОМНАЯОРГАНИЗАЦИЯИ ЭКСПРЕССИЯГЕНОВ L-ЦЕПЕЙИГ У НИЗШИХПОЗВОНОЧНЫХ
Хрящевыерыбы.
Гуморальныйиммунный ответв виде специфическихантител обнаруживаетсятолько у позвоночных.Наиболеепримитивнымивидами, у которыхобнаруженаспособностьсинтезироватьИГ, являютсяхрящевые рыбы.Представителитрех основныхтаксонов (акулы,скаты и химеры)продуцируютантитела вответ на введениеширокого спектраантигенов.Однако, в отличиеот млекопитающих,гетерогенностьсывороточныхантител ухрящевых рыбвыражена оченьслабо. Крометого, у них необнаруженосозреваниеиммунногоответа - привторичномвведении антигенаспектр антителне меняется(Flajnik, 1996). Результатыисследованийпоследних летпродемонстрировали,что организациягенов ИГ ухрящевых рыбтакже имеетярко выраженныеособенности.
Ухрящевых рыбобнаруженыгены трех типовL-цепей, локализующиесяв разных локусах.В каждом локусегеные сегментыорганизованыв кластеры,имеющие поодному V, J и C генномусегменту (рис.4). Таких кластеровсодержитсянесколькодесятков илидаже сотен водном локусена расстоянии12-15 тпн друг отдруга (Rast et al., 1994).
Геныпервого типанайдены уразнозубойакулы (Heterodontusfrancisci)(Shamblott and Litman, 1989) и малогоската (Rajaerinacea)(Anderson et al., 1995). У акулыкластеры имеютразмер 3-6 тпн.V и J, J и C генныесегментыразделеныпримерно 0,5 и 4тпн соответственно.У ската V и Jсегменты слитыв зародышевойДНК.
Генывторого типаобнаруженыу пятнистойхимеры (Hydrolaguscolliei)(Maisey, 1984), песчанойакулы (Carcharhinusplumbeus)(Hohman et al., 1992; Hohman et al., 1993), разнозубойакулы и малогоската (У всехизученныхвидов в кластерахэтого типаV и J генные сегментысоединеныуже в зародышевомгеноме. V и C гeнныесегментыразделены 2-3тпн.
Рис.4. Схема строениялокусов геновL-цепей ИГ у акулы.
Организациягенов у акулыимеет кластерныйтип. Каждыйкластер имеетразмер 3 - 6 тпни содержит поодному VL,JLи CLгенному сегменту.
Обнаруженотри типа геновL-цепей ИГ. Локусыгенов первогои третьеготипов имеютсхожую организацию.В этом случаеVLи JL,JLи CLсегментыразделеныпримерно 0,5 и 4тпн соответственно(А) (Rast et al., 1994).
Влокусе геноввторого типаVLи JLсегментысоединеныуже в зародышевомгеноме (Б).
Третийтип генов L-цепейнайден у акулы-няньки(Gynglimostomacirratum)(Greenberg et al., 1993) и разнозубойакулы (Rast et al., 1994). Вкластерахэтого типаV и J, J и C генныесегментыразделены, каки в кластерахпервого типа,примерно 0,5 и 4тпн соответственно.V и J генные сегментыфланкируютсясайтамиспецифическойрекомбинациисо спейсерами12 и 23 пн, что соответствуетконфигурацииспейсеров влокусах каппатипа млекопитающих.По первичнойструктуре генытретьего типатоже наиболееблизки к генамкаппа типавысших позвоночных(гомология поаминокислотнойпоследовательностисоставляетоколо 60%).
Геныэтих трех типовимеют междусобой низкуюстепень гомологии:40-50%по нуклеотиднойпоследовательностиС сегментови 50-60% по последовательностиV сегментов(Hohman et al., 1993).
Полученныеданные показывают,что у хрящевыхрыб имеетсяочень большоеколичествогенных сегментов.Однако спецификаорганизациигенов исключаеткомбинативноесочетаниесегментов.Все разнообразиеантител ухрящевых рыбформируетсятолько за счетэкспрессиибольшого количествакластеров.
Данныео нуклеотидныхпоследовательностяхиз разных локусоввыявили низкуюгетерогенностьгенов (85-95%), чтоуказываетна отсутствиесоматическогомутагенеза(Rast et al., 1994).
Костистыерыбы.
Анализсывороточныхантител пещерногосомика (Ictaluruspunctatus)показал наличиетрех типовL-цепей с различнымимолекулярнымимассами: 26, 24 и22 кДа. Два видаантител мыши,3F12 и 1G7, захватываютболее 90% от общегоколичестваиммуноглобулиновв реакциииммунопреципитации.При этом 3F12 антителасвязываютсяс молекулами,содержащимиL-цепи массой24 и 22 кДа, а 1G3 антителас другой субпопуляцией,содержащейL-цепи массой26 кДа. На основеэтих данныхL-цепи разделяютна два класса,называемыеF и G (Lobb et al.,1984).
Геномнаяорганизациялокуса L-цепейG типа имееткластерныйтип (рис. 5). В каждомкластере содержитсяпо одному J иC сегменту идва V сегмена.Вариабельныегенные сегментырасположенывсегда в противоположнойтранскрипционнойполярностик J и C сегментам. В ряде геномныхклонов одинV сегмент располагалсяс 3' стороны отC генного сегмента.Размер кластераравен примерно3 тпн, расстояниемежду кластерамиоколо 6 тпн (Ghaffariand Lobb, 1993; Bengten, 1994).
Хотягены L-цепейсомика имеютнизкую гомологиюс генами другихпозвоночных(40-50% по нуклеотиднойпоследовательности),их можно отнестик каппа типувысших позвоночных,так как сходствопо первичнойструктуре слямбда типомниже. Крометого, конфигурацияспейсеров имеетхарактер каппатипа: 12 пн спейсерассоциированс V, 23 пн спейсерс J сегментом(Ghaffari and Lobb, 1993).
Урадужной форели(Oncorhynchusmykiss),представителядругого семействакостистыхрыб, такжеобнаруженыдва типа L цепей(Daggfeldt et al., 1993). Один изних (L1) высокогомологиченG типу сомикапо структуреV и C областейи соответствующийлокус имеетсходную организацию.
По-видимому,у этих видовобъединениеV и J сегментовпроисходиттолько за счетинверсий свосстановлениемединой полярноститранскрипции.Разнообразиевариабельныхдоменов образуетсяв результатекомбинативногосочетанияV и J сегментовв пределах одногокластера. Неисключается,что в перестройкимогут вовлекатьсяи соседниекластеры.
Интереснойособенностьюкостистыхрыб являетсяочень высокаяпропорция мРНК,представляющейтак называемыестерильныетранскрипты(Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскриптывключают всебя толькоС-сегментыи фланкирующиеих 5’и 3’-нетранслируемыеучастки. Количествостерильныхтранскриптову сомика ифорели в 5 разпревышаетколичествополных VJC-транскриптов.
Рис.5. Геномнаяорганизациялокуса геновL-цепей ИГ упещерногосомика.
Генныесегментыорганизованыв кластеры.Каждый кластерсодержит дваVLи по одномуJLи CLсегменту иимеет размероколо 5 тпн.Расстояниемежду JLи CLоколо 1000 пн, VLсегменты удаленыот 5' конца JLсегмента на3 тпн. VLсегменты всегдарасположеныв противоположнойтранскрипционнойполярностипо отношениюJLи CLсегментам(Ghaffari and Lobb, 1993).
Амфибии.
Ушпорцевой лягушки(Xenopuslaevis)выявлено трисемействагенов L-цепейИГ, кодирующихтри различныхизотипа: L1 (ро),L2 (сигма) и L3 (рис.6).
Всетри локусаимеют сегментарныйхарактер организации.L1 локус содержитмножественныеVL1сегменты,разделенныев геноме 2.1 - 3.6 тпн,пять JL1сегментов,три из которыхидентичны,и один CL1генный сегмент(Stewart et al., 1993). JL1и VL1сегментыфланкируютсяканоническимигепта- и нонамернымисигнальнымипоследовательностями,разделенными12 пн у VL1и 23 пн у JL1сегментов(Sakano et al., 1980).
Локусгенов второготипа разделяетсяна два семейства,s1и s2,которые в геномерасполагаютсяотдельно. Геномлягушки содержитмножественныеVs1и несколькоVs2геных сегментов,одну пару Js1-Cs1и пару Js2-Cs2(Schwager et al., 1991). Расположениегенов этоготипа друготносительнодруга точноне определено.
Недавнобыл обнаружентретий типгенов L-цепейу лягушки. Вгеноме лягушкисодержитсяшесть семействV сегментовэтого типа.Общее количествоVL3элементовсоставляетпо меньшеймере 30 копий.Каждый VL3элемент можетрекомбинироватьс одной из двухпар JCL3генных сегментов(Haire et al., 1996).
Генытрех типовзначительноразличаются:гомология нааминокислотномуровне составляетприблизительно30% (Zezza et al., 1991). В то жевремя, ряд признаковпозволяетсоотнестигены L1 и L3 типас каппа и лямбдатипами млекопитающих.
Семействогенов первоготипа можноотнести к каппатипу по несколькимпричинам (Zezza etal., 1992): а) высокаягомологияпервичнойструктуры(более 50%); б) существенноесходство геномнойорганизациилокуса (многоVL1и один CL1генный сегмент);в) кофигурацияспейсеров междугепта- и нонамерымисоответствуеткаппа типу;г) JL1и CL1генные сегментыразделеныпримерно 3.5 тпн,что приблизительноравно расстояниюмежду JLkи CLkэлементамичеловека (Sakano etal., 1979; Hieter et al., 1982) и значительнобольше чемрасстояниемежду JLlи CLlмлекопитающих(Blomberg et al., 1982; Udey, 1987).
Рис.6. Геномнаяорганизациялокуса первогои третьеготипов геновL-цепей ИГ ушпорцевойлягушки.
ЛокуссемействаL1 содержитмножественныеVL1сегменты, пятьJL1сегментоводин CL1генный сегмент.Расстояниемежду VL1равно 2.1 - 3.6 тпн.Локус семействаL3 имеет около30 VL3сегментов,располагающихсягруппами, JL3и CL3сегментырасполагаютсяпарами: JCL31и JCL32(Stewart et al., 1993; Haire et al., 1996).
Третийтип генов L-цепейлягушки болееблизок к лямбдатипу млекопитающих:а) более высокаягомология сгенами лямбдатипа млекопитающих(около 50% с l-и 30-40% с k-типомпо аминокислотнойпоследовательности);б) JL3и CL3генные сементыэкспрессируютсявсегда парамиJL31-CL31и JL32-CL32,что напоминаетситуацию влямбда локусечеловека имыши (Haire et al., 1996).
Гены второготипа L-цепейлягушки незначительноеи приблизительноодинаковоесходство сгенами каппаи лямбда типовмлекопитающих(30-40% и 25-40% по нуклеотиднойпоследовательности,соответствено)(Schwager et al., 1991).
Генетическоеразнообразиеу лягушкидостаточновелико и сравнимос разнообразиемгенов у млекопитающих.Однако репертуарантительныхспецифичностейв сывороткекрови значительноуступаетрепертуарувысших позвоночных(Hsu et al., 1991). Этот парадоксможно объяснитьналичиеммеханизмасоматическойселекции клоновВ-лимфоцитов,который элиминируетклетки, несущиеантитела,специфичныек собственнымантигенаморганизма,а также теклетки, которыепродуцируютнесколько типовантител (Wilson et al.,1992).
Основнойвклад в формированиеразнообразияL-цепей антителу лягушки даютпервое и третьесемействагенов, имеющиевысокий комбинативныйпотенциал ибольшое разнообразиезародышевыхV генных (Haire et al.,1996). Второе семействоимеет несколькослабо отличающихсядруг от другаVL2элементов ине играетсущественнойроли в формированииразнообразия(Stewart et al., 1993). Такимобразом, разнообразиегенов L-цепейу лягушки асоздаетсяпосредством:а) комбинативногосоединенияV и J генныхсегментов;б) смещениярекомбинационнойрамки при соединенииV и J сегментов.Нельзя исключить,что определенныйвклад в разнообразиеможет вноситьсоматическиймутагенез.Во всяком случае,наличие этогомеханизмапоказано длягенов H-цепейлягушки (Zezza et al.,1992).
ЭВОЛЮЦИЯГЕНОВ L-ЦЕПЕЙИГ
Согласнонаиболеепопулярной внастоящиймомент гипотезегены ИГ и Т-клеточныхрецепторовпроизошли отодного предковогогена, кодировавшегоодин доменпутем различныхвариантовпоследовательныхдупликаций(рис. 7).
Вэволюции геновИГ можно выделитьтри основныхсобытия.
1.РазделениепредковогоV-подобногогена на V и Jсегменты ивозникновениемеханизмагенерацииразнообразияпутем соматическойрекомбинации.Предпологается,что это событиесвязано свнедрениемтранспозонав предковыйген и осуществилосьдо разделенияИГ и Т-клеточныхрецепторов упредков хрящевыхрыб (Gilbert, 1990). Наличиев геноме акули скатов слитыхVJ генов в локусахL-цепей классовI и II, является,по-видимому,вторичнымсобытием и,возможно,обусловленофиксациейгенов, кодирующихантитела строгоопределеннойспецифичности(Anderson et al., 1995).
2.Возникновениемеханизмовсоматическогомутагенезагенов ИГ. Умлекопитающихсоматическиймутагенезобеспечиваеткак минимумполовинуразнообразияантител, являясьосновой аффинногосозреванияантител привторичномиммунномответе (Пол,1987). Достаточновыражен соматическиймутагенезтакже у птиц(Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).
Рядданных позволяетпредполагать,что соматическиймутагенезможет осуществлятьсяу хрящевых рыби у амфибий,но эти результатынуждаются вболее тщательномизучении. Вчастности,у хрящевых рыбполучениедостоверныхсвидетельствзатрудненоналичиеммножественыхкластеровгенов, что непозволяетнадежно соотноситьданные по геномнойструктуре иструктуре кДНК(Litman et al., 1993).
3.Переход откластернойк сегментарнойорганизациигенных сегментов.Сегментарнаяорганизацияможет иметьнесколькопреимуществ.Во-первых,увеличиваетсяразнообразиепродуцируемыхантител засчет дополнительныхвозможностейкомбинированияразных V и J сегментов.Во-вторых,уменьшаетсяразмер локусаза счет
Рис.7. Гипотетическаясхема эволюцииструктурнойорганизациилокусов геновL-цепей ИГ позвоночных.(Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).
Обозначения: - сигнальныеолигомеры,фланкирующиеV и J сегменты.резкогосокращенияколичестваC генов. В-третьих,подобная организацияпозволяетупроститьрегуляциюэкспрессииразличныхлокусов.
Ключевымпринципомфункционированияиммуннойсистемы являетсяпринцип клональнойселекциииммунокомпетентныхклеток, несущихрецептор определеннойспецифичности.Ряд косвенныхданных позволяетсчитать, чтоу акул гуморальныйиммунный ответклональноограничен(Shankey and Clem, 1980). Однаконеизвестно,каким образоми насколькоэффективноосуществляетсяэто ограничение(Flajnik, 1996). У млекопитающихпринцип “однаклетка - одноантитело”обеспечиваетсяблагодаряизотипическомуи аллельномуисключению.При сегментарнойорганизациигенов продуктивнаяперестройкав одном из локусовведет к блокированиюперестройкидругих локусови, тем самымк их инактивации.Однако, в случаеналичия множественныхVJC кластеров,в части изкоторых VJ сегментыслиты в зародышевойДНК, механизмыконтроля выборочнойэкспрессиимогут бытьболее сложнымиили не стольэффективными.Таким образом,переход откластернойк сегментарнойформе организациигенов ИГ могиметь принципиальноезначение дляформированияполноценнойсистемы гуморальногоиммунитета.
Вопросо том, на какомэтапе филогенезапроизошел этотпереход остаетсяоткрытым. Ужеу амфибий геныИГ L- и Н-цепейорганизованысегментарно.При этом, в случаеL-цепей наблюдаетсядва основныхтипа организации:каппа-подобный(один С ген,семействоJ сегментови семействоV сегментов)и лямбда подобный(несколько парJC и семействоV сегментов).По всей видимости,различныетипы L-цепейамфибий произошлиот различныхтипов L-цепейхрящевых рыб,однако относительноневысокаягомология попервичнойструктуре непозволяетутверждатьэтого с определенностью(Gilbert, 1990).
Усомика и радужнойфорели, представителейкостистыхрыб, организациягенов L-цепейи Н-цепей отличается.Гены Н-цепейкостистыхрыб организованыподобно млекопитающимсегментарно(Bengten et al., 1991). Организациягенов L-цепейимеет кластерныйхарактер. В тоже время, в отличиеот хрящевыхрыб, транскрипционнаяориентацияV генов у нихизменена.
Следуетотметить, чтосомовые илососевыеявляются довольноспециализированнойгруппой, возникшейв эволюцииотносительнонедавно (Рис.8). Особенностиорганизациигенов легкихцепей у этихтаксонов могутпредставлятьсобой новоприобретенныепризнаки (Romer,1966).
Всвязи с этимособый интереспредставляетизучениеструктры иорганизациигенов L-цепейИГ у костно-хрящевыхрыб. Костно-хрящевыеявляются архаичнойгруппой костистыхрыб, возникшейзначительнораньше настоящихкостистых.Несмотря нато, что существуютразличныемнения относительнопоследовательностипоявлениякостно-хрящевыхи двоякодышащих(предков наземныхпозвоночных)(Ромер и Парсонс,1992; Юдкин И. И.,1941), очевидно,что костно-хрящевыев большей степеничем коститстыесохраниличерты древнихпервично-костныхрыб и, соответственно,с большимоснованиеммогут рассматриватьсякак промежуточноезвено междухрящевымирыбами и амфибиями.
Рис.8. Эволюционноедрево низшихпозвоночных( по СеверцевуА. Н., 1939).
Обозначения: - таксоны, имеющиеныне живущихпредставителей, - таксоны,существованиекоторых доказанопалеонтологическимиисследованиями.МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗДНК
Вагарозномгеле.
ЭлектрофорезДНК проводилив 1% агарозномгеле в 1-кратномбуфере ТАЕ,имеющем состав:0.04 М трис-ацетат,2 мМ Na2ЭДТА(Маниатис идр., 1984).
Вполиакриламидномгеле.
ЭлектрофорезДНК проводилив 6% полиакриламидномгеле в 0,5-кратномбуфере ТБЕ,имеющем состав:0,089 М трис-борат,0,089 М борная кислота,2 мМ Na2ЭДТА.Для полимеризациигеля к 50 мл растворадобавляли 300мкл 10% раствораперсульфатааммония и 30 мклТЕМЕД (Маниатиси др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕДНК ИЗ ГЕЛЯ
Адсорбцияна диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гельокрашивалив растворебромистогоэтидия, участокгеля с полосойДНК вырезали,помещали вкамеру и переносилиДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозув 0,5-кратномбуфере ТБЕ(см. ЭлектрофорезДНК (2)) при напряжении40 В/см. ЭлюциюДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозыпроводили путеминкубированияв течение 30 минпри 70оСв буфере, имеющемсостав: 2 мМNaCl, 1 мМ Na2ЭДТА,40 мМ трис рН 8,0(Маниатис идр., 1984).
Адсорбцияна кремниевойпудре.
Агарозныйгель окрашивалив растворебромистогозтидия, вырезалиучасток геляс ДНК и расплавлялиинкубированиемс двойным объемом6 М раствораKI в течение 10мин при 55оС.Затем добавлялисуспензиюкремниевойпудры (силики)в 3 М раствореKI в концентрации100 мг/мл из расчета300 мкг силикина 1 мкг ДНК иинкубировалив течение 2 минпри 55оС.После этогоосаждали силикуцентрифугированиемпри 2000 g в течение2 мин и дваждыпромывалисуспендированиемв растворе,содержащем50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl,рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТАи 50% этиловыйспирт. ЭлюировалиДНК с силикисуспендированиемв воде (Boyle, Lew, 1995).
Замораживание- оттаивание.
Агарозныйгель с ДНК 10 мининкубировалив жидком азотеи осаждалицентрифугированиемпри 12000 g в течение15 мин, после чегодобавляли ксупернатанту1/10 объема 3 М NaAc,2 объема этанолаи осаждалиДНК при 12000 g в течение10 мин.
ПОЛУЧЕНИЕРАДИОАКТИВНЫХЗОНДОВ
500нг ДНК-матрицыи 100 нг праймераденатурировалив 10 мкл воды при100оСв течение 10 мини быстро охлаждалидо 0оС.Затем добавляли10 мкл 10-кратногобуфера (40 мМ KP04рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2и 1,0 мМ 2-меркаптоэтанол),0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ,10 мкл 2 мМ растворатрех другихнемеченыхдНTФ до концентрации200 мкМ. Объемреакционнойсмеси доводиливодой до 100 мкл,добавляли 3 мклфрагментаКленова ДНК-полимеразыI (10-12 е.а.) и инкубировалипри комнатнойтемпературев течение 30 мин.Очистку зондапроводили методомгель - фильтрациина колонке сбиогелем П-10(Маниатис идр., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕПЛАЗМИДНОЙДНК
КлеткиEscherichiacoli,выращенныев среде Луриа-Бертани(1% NaCl, 1% бакто-триптон,0,5% бакто-дрожжевойэкстракт, рН7,5) (среда LB) с ампициллином(50 мкг/мл), осаждалицентрифугированиемпри 4000 g. Затемосадок суспендировалив буфере STET (8% сахароза,0,5% тритон X-100, 10 мМтрис-HCl и 50 мМNa2ЭДТА,рН 8,0) и добавлялилизоцим доконцентрации0,8 г/мл. Смесьинкубировалипри комнатнойтемпературев течение 5 мини при 100оСв течение 1 мин.После этогоклеточныйдебрис осаждалицентрифугированиемпри 16000 g в течение15 мин.
ДляосажденияплазмиднойДНК к супернатантудобавляли 1/10объема 3 М раствораацетата натрия,равный объемизопропанолаи центрифугировалипри 16000 g в течение15 мин при 20оС.Затем промывалиосадок добавлением80% этанола иповторнымцентрифугированиемв течение 5 минпри 20оС(Маниатис идр., 1984).
ОЧИСТКАПЛАЗМИДНОЙДНК МЕТОДОМРАВНОВЕСНОГОЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯВ ГРАДИЕНТЕПЛОТНОСТИCsCl
Накаждые 10 мл раствораплазмиднойДНК, полученногопосле осаждениялизированныхклеток (см.ВыделениеплазмиднойДНК), добавляли1 г сухого CsCl, сольрастворяли,после чего накаждые 10 мл растворадобавляли 0,8 млраствора бромистогоэтидия с концентрацией10 мг/мл. Смесьпомещали вцентрифужныепробирки Beckman,заполнялидоверху растворомCsCl и бромистогоэтидия тойже плотностии центрифугировалив роторе Ti 60 при45000 об/мин и температуре20оСв течение 36часов. Послеэтого отбираликольцевуюковалентнозамкнутуюплазмиднуюДНК и экстрагировалибромистыйэтидий израствора дополного обесцвечиванияравным объемомн-бутанола,предварительнонасыщенного1 М растворомNaCl.
ДНКосаждалицентрифугированиемпри 15000 g, добавивравный объем1 М раствораNH4Clи два объемаэтанола. Послепромыванияэтанолом осадокДНК растворялив воде до концентрации1 мкг/мкл (Маниатиси др., 1984).
ТРАНСФОРМАЦИЯПРОКАРИОТИЧЕСКИХКЛЕТОК
Химическаятрансформация.
Дляподготовкикомпетентныхклеток E.coliштамм XL-1 Blue MRF ' ивыращивалив 100 мл 2-кратнойсреды Луриа(2% бакто-триптон,1% бакто-дрожжевойэкстракт, 0,1%NaCl, 0,4% глюкоза, рН7,0) при 37оСдо оптическойплотностиD550=0,35.Клеточнуюсуспензиювыдерживалипри 0оСв течение 2часов. Затемклетки осаждалицентрифугированиемпри 4000 g, температуре4оСи суспендировалив 50 мл ледяногобуфера А (100 мМCaCl2,70 мМ MnCl2,40 мМ NaAc, рН 5,5). Послеэтого суспензиюклеток выдерживалипри 0оСв течение 30 мин,после чегоклетки осаждалии суспендировалив 5 мл буфераА с 15% глицерина.
Длятрансформациик 200 мкл суспензиикомпетентныхклеток добавляли30 нг плазмиднойДНК, раствореннойв 100 мкл воды ивыдерживалипри 0оСв течение 30 мин.Затем инкубировалипри 37оСв течение 5 мин,после чегодобавляли 3 млсреды LB и инкубировалипри 37оСеще 90 мин. Клеткисобиралицентрифугированиеми высевалина селективнуюсреду (Мазини др., 1988).
Электротрансформация.
Дляподготовкикомпетентныхклеток E.coliштамм XL-1 Blue MRF ' выращивалив 100 мл среды LB (см.Химическаятрансформация)при комнатнойтемпературедо оптическойплотностиD550=0,45.Затем клеткиосаждалицентрифугированиемпри 4000 g, 4оСи промывалисуспендированиемпоследовательнов 100 мл, 50 мл и 10мл10% раствораглицерина при0-4оС.После этогоклетки суспендировалив 240 мкл ледяногораствора GYT (10%глицерин, 0,125%бакто-дрожжевойэкстракт, 0,25%бакто-триптон).
Длятрансформациик 40 мкл суспензиикомпетентныхклеток добавляли1 мкл ДНК вектора(50 нг) при 0-4оСи пропускалиэлектрическийразряд (U=18000 В). Затемдобавляли 1 млSOC (2% бакто-триптон,0,5% бакто-дрожжевойэкстракт, 10 мМNaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2,10 мМ MgSO4,20 мМ глюкоза),перемешивали,переносилив 3 мл среды SOC,прогретой до42оС,и инкубировалипри 37оСв течение 1 часа(Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).
ВЫДЕЛЕНИЕЛЕЙКОЦИТОВИЗ КРОВИ РЫБ
Кровьсобирали нахолоду черезкаудальнуюартерию с добавлениемна каждые 5 млкрови 1 мл 2,7% раствораNa2ЭДТА,рН 7,4. К выделеннойкрови добавлялиравный объемтрис-солевогобуфера (TBS) (0,14 МNaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ трис-HCl,рН 7,4). Смесь наносилипри комнатнойтемпературена равный объемсреды для выделениялейкоцитов,содержащей24 части 9% фиколаи 10 частей 34%верографина.После центрифугированияпри 400 g в течение30 мин отбиралислой лейкоцитови разводилив большом объемебуфера TBS. Послеповторногоцентрифугированияпри 300 g в течение40 мин для лизисаостаточныхэритроцитовклетки суспендировалив растворе,содержащем9 объемов 0,83% раствораNH4Clи 1 объем 2,06% растворатрис-HCl, рН 7,62, доконцентрации108кл/мл и добавляли5 объемов среды.После осажденияклеток при 300 gв течение 10 минпроцедуру очисткиповторили(Фримель, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕСУММАРНОЙРНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ
Осадоклейкоцитовпосле выделенияи очисткисуспендировалив 10 объемах (1мл) раствора1, содержащего4 М гуанидинтиоцианат,25 мМ цитратнатрия, рН 7,0, 0,5%саркозил и0,1 М 2-меркаптоэтанол,при комнатнойтемпературе.Затем добавляли0,1 мл 2 М раствораNaAc, рН 4,0, 1 мл фенола,0,2 мл хлороформаи перемешивали.Затем центрифугировалипри 10000 g в течение20 мин при 4оС,отбирали воднуюфазу, добавлялик ней равныйобъем изопропанолаи осаждалиРНК центрифугированиемпри 15000 g в течение15 мин при 4оС(Chomczynski and Sacchi, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХКЛЕТОК
1г печени стерляди,замороженнойв жидком азоте,растирали втонкий порошоки гомогенизировалив 15 мл раствора,содержащего0,5 М Na2ЭДТА,рН 8,0, 0,5% саркозила,100 мкг/мл протеиназыК и нагретогодо 65оС.Затем инкубировалипри 50оСтечение 3 часовпри легкомпокачивании.Затем, избегаярезких встряхиваний,экстрагировалиДНК равнымобъемом фенолатри раза, каждыйраз разделяяфракции центрифугированиемпри 4000 g и комнатнойтемпературе.Фенол предварительноочищали перегонкойи насыщалибуфером, содержащим1 М трис-HCl, одинраз и два разабуфером, содержащим0,1 М трис-HCl и 0,1%2-меркаптоэтанол.Диализ ДНКпроводили при10оСв течение 12часов против4 л буфера, имеющегосостав:
50мМ трис-HCl, рН8,0,
10мМ Na2ЭДТА,
10мМ NaCl.
Затемобрабатывалипробу РНКазой,свободной отДНКазы,при 37оСв течение 1 часав концентрации100 мкг/мл. Послеэтого экстрагировалиДНК равнымобъемом смесифенол-хлороформ(1:1) два раза ипроводили диализпри 10оСв течение 36часов против10 л буфера TE (10 мМтрис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА,рН 7,5), меняя буферчерез каждые12 часов (Маниатиси др., 1984).
КОНСТРУИРОВАНИЕБИБЛИОТЕКИкДНК
Выделениеполи(A)+РНК.
ДляингибированияРНКазы всерастворы, несодержащиетрис, обрабатывали0,1% диэтилпирокарбонатом12 часов при 37оСи автоклавировали.Посуду прокаливалипри 250оСв течение 4часов. Поли(A)+РНКвыделяли изсуммарнойРНК лейкоцитовстерляди методомхроматографиина олиго(dT)-целлюлозе.Для этого РНКрастворялив воде, прогревалипри 65оСв течение 5 мин,добавляли равныйобъем 2-кратногобуфера длянанесенияРНК (40 мМ трис-HCl,рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА,0,2% SDS) и триждыпропускаличерез колонкус олиго(dT)-целлюлозой.Затем промываликолонку 5-10 объемамибуфера длянанесенияи 4 объемамиэтого же буфера,содержащего0,1 М NaCl. После этогоэлюировалиполи(A)+РНКв 2-3 объемахводы, обработаннойдиэтилпирокарбонатом,добавляли 2,2объема этанолаи осаждалицентрифугированиемв течение 10 минпри 12000 g при 4оС(Маниатис идр., 1984).
СинтезкДНК.
СинтезкДНК проводилив соответствиис протоколомфирмы Stratagene. По матрицеполи(A)+РНКсинтезировалипервую цепькДНК (рис. 9).
Реакционнаяимела состав:
5мкл 10-кратногобуфера длясинтеза первойцепи,
3мкл смесиметил-dНTФ,
2мкл растворапраймер-линкера(1.4 мкг/мкл),
1мкл ингибитораРНКазнойактивности,
1.5мкл ферментаобратнаятранскриптаза(50 е.а./мкл),
водадо суммарногообъема 50 мкл.
Смесьинкубировалипри 37оСв течение 1 часа.Затем охлаждалидо 0оСи добляли компонентыдля синтезавторой цепикДНК:
20мкл буфера длясинтеза второйцепи,
6мкл смеси dНTФ,
88,9мкл стерильнойводы,
2мкл 32Р-dНTФ(800 Ки/мМ),
2мкл раствораРНКазыH (1.5 е.а./мкл),
11.1мкл ДНК полимеразыI.
Смесьинкубировалипри 16оСв течение 2,5часов, затемохлаждали до0оСи добавляликомпонентыдля застройки“липких” концов:
23мкл смеси дНTФ,
2мкл PfuДНК полимеразы(2,5 е.а./мкл).
Смесьинкубировалипри 72оСв течение 30 мин.
Затемпроводилиэкстракциюравным объемомсмеси фенол-хлороформ(1:1) и равным объемомхлороформа,после чегоотбирали воднуюфазу, добавляли20 мкл 3М NaAc и 400 мкл96% этанола иосаждали кДНКцентрифугированиемпри 12000 g в течение12 мин.
Сшивкамолекул кДНКс вектором.
кДНКрастворялис EcoR I адапторами(рис. 9) и инкубировалипри 4оСв течение 30 мин.Затем добавляликомпонентыдля сшивкимолекул адапторови молеул кДНК:
праймер-линкер
5'CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3'
3' AAAAAAAAAAAA 5' 
поли(A)+РНК 
XhoI сайт 1-я цепь EcoR I адаптор
5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-р 3' 3' р-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-р 5' 
2-яцепь 
Xho I сайт кДНК EcoR I сайт
5' CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC 3’ 3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’ДНКвектора ДНК вектора
Рис.9. Схема синтезакДНК по матрицеполи(A)+РНКи сшивки сплазмиднымвектором
pBluescriptKS(+) по сайтамEcoR I и Xho I.
Обозначения:,,,,,- метилированнаяцепь кДНК, -неметилированнаяцепь кДНК.1 мкл10-кратного буфералигирования,
1мкл 10 мМ рATФ,
1мкл ферментаДНК лигазыфага Т4 (4 е.а./мкл).
Смесьинкубировалипри 4оСв течение 2-хсуток, послечего инактивировалилигазу прогреваниемпри 70оСв течение 30 мин,охлаждали докомнатнойтемпературыи добавляликомпонентыдля фосфорилированияконцевыхнуклеотидов:
1мкл 10-кратногобуфера лигирования,
2мкл 10 мМ рATФ,
6мкл стерильнойводы,
1мкл ферментаполинуклеотиднойкиназы фагаТ4 (10 е.а./мкл).
Реакционнуюсмесь инкубировалипри 37оСв течение 30 мин.Затем охлаждалидо комнатнойтемпературыи добавляликомпонентыдля образованиялипких концовпо сайту рестрикцииэндонуклеазыXho I:
28мкл буфера 4,
3мкл Xho I (40 е.а./мкл).
Смесьинкубировалипри 37оСв течение 1,5часа. Затемдобавляли 5 мкл10-кратного буфераSTE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl,рН 7,5, 100 мМ Na2ЭДТА)и пропускаличерез колонкус гелем сефакрилС-500. Фракции,содержащиемолекулы сразмером более500 пн объединялии экстрагировалиДНК равнымобъемом смесифенол-хлороформ(1:1) и равным объемомхлороформа.Затем добавлялидвойной объемэтанола, осаждаликДНК центрифугированием,промывали 80%этанолом ирастворялив 10 мкл воды. Длялигированиябрали 5 мкл растворакДНК (600 нг) и 2 мклраствора вектораpBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего"липкие"дефосфорилированныеконцы по сайтамрестрикцииэндонуклеазамиEcoR I и Xho I (рис. 9).
Затемдобавляли 1 мкл10-кратного буфера3, 1 мкл 10 мМ растворарATФ и 1 мкл ферменталигазы фагаТ4 (4 е.а./мкл). Смесьинкубировалипри 4оСв течение 2-хсуток, послечего экстрагировалиравными обьемамифенол-хлороформаи хлороформа.
Амплификациябиблиотеки.
Электротрансформациюпроводили какописано в п.Трансформацияпрокариотическихклеток, послечего высевали1/1000 объема (2,5 мкл)среды SOC на селективнуюсреду с ампициллином(50 мкг/мл) дляопределенияколичестватрансформированныхклеток. Остальнуючасть помещалив 100 мл среды LB сампициллином(50 мкг/мл) и инкубировалипри 37оСпри перемешиваниидо тех пор, покаоптическаяплотность недостигнетвеличиныD550=2-2,5.Затем отбирали1,6х1011клеток, осаждалиих центрифугированием,суспендировалив 4 мл среды LB иперемешивалис 4 мл глицерина.Полученнуюбиблиотекухранили при-70оС.
ПОЛИМЕРАЗНАЯЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционнаясмесь полимеразнойцепной реакции(ПЦР) содержаласледующиекомпоненты:
100нг ДНК матрицы,
100нг невырожденногопраймера,
500нг вырожденногопраймера,
5мкл 2 мМ растворадНTФ,
5мкл 1-кратногобуфера (10 мМтрис-HCl, рН 8,8, 50 мМKCl, 1,5 мМ MgCl2,0,001% желатин),
1мкл Taq полимеразы,
водадо конечногообъема 50 мкл(Dieffenbach and Dveksler, 1995).
Температурныйрежим ПЦР.
Реакционнуюсмесь инкубировалипри 95оСв течение 5 мин,после чегодобавляли Taqполимеразуи использовалитемпературныйрежим, при которомв течение первых18 циклов температуруотжига праймеровпонижали на3оСчерех каждыетри цикла:
1й-18йциклы 95оС- 1 мин (денатурацияДНК),
50-35оС- 1 мин (отжигпраймеров),
72оС- 2 мин (полимеризация).
19-й-30-йциклы: 95оС - 1 мин,
50оС- 1 мин,
72оС- 2 мин.
31-йцикл: 95оС- 1 мин,
50оС- 1 мин,
72оС- 10 мин.
СУБКЛОНИРОВАНИЕДНК
ФрагментыДНК, полученныев результатеПЦР, разделялив 1% агарозномгеле и выделяликак описанов п. ВыделениеДНК из геля.Затем осаждалиДНК этанолом,растворялив 5-10 мкл воды идобавляликомпонентыдля удалениявыступающихнуклеотидовс 3' конца ДНК:
1мкл 10-кратногобуфера (200 мМтрис-HCl, рН 8,2, 100 мМKСl, 60 мМ (NH4)2SO4,20 мМ MgCl2,1% тритон Х-100 и100 мкг/мл бычийсывороточныйальбумин),
1мкл 10 мМ dНTФ,
1мкл PfuДНК полимеразы(2,5 е.а./мкл),
водудо конечногообъема 10 мкл.
Смесьинкубировали30 мин при 72оСпосле чегоохлаждали до0оСи добавляликомпонентыдля сшивки свектором pBluescriptKS(+) по сайтурестрикцииSma I:
1мкл расщепленноговектора (0,5 мкг),
1мкл 10-кратногобуфера (50 мМтрис-HCl, рН 7,5, 7 мМMgCl2,1 мМ ДТТ),
1мкл 10 мМ дATФ,
1мкл ДНК лигазыфага Т4 и водудо конечногообъема 10 мкл.
Смесьинкубировалиодни суткипри комнатнойтемпературеи затем использовалидля химическойтрансформацииклеток E.coli.Трансформированныеклетки высевалина селективнуюсреду: 1,5% LB-агарс ампициллином(50 мкг/мл), тетрациклином(15 мкг/мл), ИПТГ(2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл)и инкубировали14 часов при 37оС.После этогоотбирали колониибелого цвета(Маниатис идр., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).
СКРИНИНГБИБЛИОТЕКИкДНК
БиблиотекукДНК высевалина чашки Петрис 1,5% LB-агаром сампициллином(50 мкг/мл) из расчета4000 колоний начашку и инкубировалипри 37оСдо тех пор покаколонии недостигнут0,5-1 мм в диаметре.Колонии переносилина нейлоновуюмембрану иинкубировалипри комнатнойтемпературев денатурирующемрастворе (0,5 МNaOH, 1,5 М NaCl) в течение7 мин и два разапо 2 мин в нейтрализующемрастворе (1,5 МNaCl, 0,5 М трис-HCl, рН7,5). Затем споласкивалимембрану в2-кратном буфереSSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитратнатрия), высушивалии фиксировалиДНК в течение10 мин ультрафиолетовымизлучениемс длиной волны310 нм. После этогомембрану помещалив 50 мл предгибридизационногораствора (раствор1), содержащего:
6-кратныйSSC (0.9 М NaCl, 0,09 М цитратнатрия),
5-кратныйраствор Денхардта(0,1% бычий сывороточныйальбумин, 0,1%фикол, 0,1% поливинилпиролидон),
0,5%SDS,
10%декстран сульфат,
500мкг денатурирированнойДНК цыпленка,
иинкубировали1 час при 55оС.После этогодобавлялимеченую 32P-дATФДНК зонда иинкубировали12-18 часов при 55оСпри постоянномпокачивании.
Послегибридизациипроводилипромываниемембраны двараза по 10 минв 200 мл 2-кратногоSSC + 0,1% SDS при комнатнойтемпературе,15 мин в 1-кратномSSC + 0,1% SDS% при 55оСи два раза по10 мин в 0,1-кратномSSC + 0,1% SDS при 55оС.Экспонированиепроводилосьв течение 12часов при -70оСс рентгеновскойпленкой (Маниатиси др., 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕНУКЛЕОТИДНОЙПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИДНК
НуклеотиднуюпоследовательностьДНК определялипо методу Сэнгера(Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмиднойДНК, очищенойгель-фильтрациейна колонке сбиогелем П-10,денатурировалив 50 мкл 0.2 М NaOH при37оСв течение 30 мин,затем добавляли5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойнойобъем этанолаи инкубировали30 мин при температуре-70оС.После этогоосаждали ДНКцентрифугированиемпри 12000 g в течение12 мин и промывалиосадок 100 мкл80% этанола. ОсадокДНК высушивалипри комнатнойтемпературеи растворялив 7,5 мкл воды,добавляли 2 мкл5-кратного буфера(200 мМ трис-HCl, рН7,5, 100 мМ MgCl2,250 мМ NaCl), 0,5 мкл праймера(50 нг) и инкубировали30 мин при 37оС.После этогопробирку помещалив лед и добавляли1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл1,5 мкМ дНTФ бездATФ, 0,5 мкл раствора35S-дATФи 2 мкл ДНК полимеразыфага Т7 (2,5 е.а./мкл).Затем инкубировали3 мин при 20оСи сразу отбиралипо 3,5 мкл в четырепробирки, каждаяиз которыхсодержала по2,5 мкл 80 мкМ смесичетырех дНTФ,50 мМ NaCl и 8 мкМ одногоиз ддНTФ. Инкубировали5 мин при 37оСи добавлялипо 4 мкл стоп-раствора(95% формамид, 20 мМNa2ЭДТА,0,05% бромфеноловыйсиний, 0,05% ксиленцианол). Полученныеобразцы инкубировали3 мин при 100оС,быстро охлаждалидо 0оСи отбиралипо 2 мкл дляэлектрофорезав денатурирующемполиакриламидномгеле, имеющемсостав:
6%акриламид,
8М мочевина,
1-кратныйглицерин-толерантныйбуфер (1,1% трис,0,36% таурин, 0,02% Na2ЭДТА).
Электрофорезпроводили принапряжении40 В/см. Затемгель выдерживали30 мин в 10% укскснойкислоте, высушивалии экспонировали12 часов прикомнатнойтемпературес рентгеновскойпленкой (Маниатиси др., 1984).
САУЗЕРНБЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ
10мкг геномнойДНК, выделеннойиз печенистерляди, инкубировалив течение 2 часовс эндонуклеазамирестрикцииPstI и PvuII (по 50 е.а.) при 37оСв буфере, содержащем100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl,рН 7,5, 10 мМ MgCl2,100 мкг/мл бычийсывороточныйальбумин, 6 мМ2-меркаптоэтанол.Затем экстрагировалиДНК последовательноравными объемамифенол-хлороформа(1:1) и хлороформа,осаждали ДНКдвумя объемамиэтанола, растворялив воде и наносилина 1% агарозныйгель. Электрофорезпроводили принапряжении1 В/см и температуре12оСв течение 12часов. Затемгель инкубировалипри комнатнойтемпературе30 мин в 0,25 М HCl, 30 минв денатурирующемрастворе (0,5 МNaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин врастворе 1 (0,25 МNaOH, 1,5 M NaCl). После этогоДНК переносилина нейлоновуюмембрану методомвакуумногопереноса врастворе 1. Мембранусполаскивалив 2-кратном SSC,высушивалии фиксировалиДНК в течение10 мин ультрафиолетовымизлучениемс длиной волны310 нм.
Предгибридизациюпроводили при55оСв течение 1 часав растворе 1(см. СкринингбиблиотекикДНК). Гибридизациядлилась 12-16 часовпри 55оСс концентрациейзонда не более10 нг/мл.
Отмывкупроводили двараза по 10 минв 2-кратном SSC +0,1% SDS при комнатнойтемпературеи один раз 15 минв 1-кратном SSC +0,1% SDS при 55оС.Экспонированиедлилось 12 часовпри -70оС(Маниатис идр., 1984).
РЕЗУЛЬТАТЫ
КОНСТРУИРОВАНИЕБИБЛИОТЕКИкДНК И ЕЕ СКРИНИНГ
ВкачествеисточникамРНК бралилейкоцитыпериферическойкрови стерляди.На основе этоймРНК синезироваликДНК. Полученныемолекулы кДНКклонировалив плазмидномвекторе pBluescript KS(+),после чеготрансформировалиэтим векторомклетки E.coliштамма XL-1 Blue MRF’.В результатеэтого былаполучена библиотекакДНК представительностью6 миллионовклонов. Библиотекуамплифицировалидо объема 5 х1011клеток.
CуммарнуюплазмиднуюДНК библиотекивыделяли ииспользовалив ПЦР с паройпраймеров, одиниз которыхгомологичненучастку векторавблизи сайтаклонированиямолекулы кДНКи располагаетсяв кодирующейориентации.Второй праймервырожденный,соответствующийнаиболееконсервативномуучасткупоследовательностиJ-сегментовL-цепей ИГ позвоночныхв некодирующейориентации(рис. 10).
Одиниз фрагментовДНК, полученныхв результатеПЦР, соответствоваложидаемомуразмеру (370 пн).Этот фрагментвыделяли исубклонировалив векторе pBluescriptKS(+). Определениенуклеотиднойпоследовательностиэтого фрагментапоказало, чтоон гомологиченгенам V областиL-цепей ИГ (Рис.11).
Этотфрагмент былиспользованв качествезонда для скринингабиблиотекикДНК лейкоцитовстерляди. Скрининг4000 колоний библиотекикДНК в мягкихусловияхгибридизациипозволил выявитьпять клоновс размеромвставки кДНКот 800 до 1050 пн. Длячеткого разделенияклонов проводиливторичныйскринингбиблиотекикДНК, после чеговыделенныеклоны амплифицировали.
прамерТ3
5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';
J-праймер
5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’
Рис.10. Схема ПЦР. Т3праймер располагаетсявблизи сайтаклонированиямолекулы кДНКи комплиментареннекодирующейцепи, J-праймергомологиченучастку кодирующейцепи J-сегментагенов L-цепейИГ позвоночных.Ожидаемаядлина продуктовоколо 400 пн.
ОПРЕДЕЛЕНИЕПЕРВИЧНОЙСТРУКТУРЫ
Определенануклеотиднаяпоследовательностьвставки кДНКклона В1. кДНКклона В1 размером1050 пн представляласобой полноразмернуюкопию зрелогогена L-цепи ИГи содержала5’-нетранслируемуюобласть,последовательностькодирующуюлидерный пептид,V область, Собласть, а также 3’-нетранслируемуюобласть (Рис.11). На основепервичнойструктурыклона В1 сконструировалии синтезировалитри праймера,соответствующихконсервативнымрайонам V и Cобласти ииспользовалиих для определениянуклеотиднойпоследовательностиклонов Е4 и С2.Последовательностьклона Е4 былаопределенатолько в области,примыкающейк Т3 промоторувектора. Заисключением2 нуклеотидовона полностьюидентичнапоследовательностиВ1. Последовательностьклона С2 имелахимерный характер.В области Т3промотора онасодержалафрагментсоответствующий3’ части С сегментаклона B1 с заменаминесколькихнуклеотидов.В то же времяиспользованиедля определенияпоследовательностипраймеров V иC области показало,что эта вставкасодержитдополнительноперестроенныйген легкойцепи, содержащийбольшую частьV сегмента ивторой С сегмент,отличающийсяот первого водной позиции.Поскольку покане удалосьопределитьпоследовательностьв области стыкаэтих двухфрагментоввставки, нельзясказать, находятсяли они в однойили разныхориентациях.По-видимому,сходный химерныйхарактер имеетпоследовательностьклона D2 (данныене показаны).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙАНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙСТРУКТУРЫ
Нуклеотиднуюи предсказанныеаминокислотныепоследовательностиклона В1 сравнивалис последовательностямиV и C генов L-цепейИГ других видовпозвоночных(Рис 12). На аминокислотномуровне V областьимеет наибольшеесходство сV-областямиL-цепей классаF и G пещерногосомика и сV-областью L1класса ИГ форели(63-71%). И те и другиеотносятся ккаппа-типу L-цепей. При поискегомологов вполном банкепоследовательностейИГ млекопитающихпервые 100 позицийс наибольшимсходствомпредставлялисобой такжеV каппа области.
С-областьклона В1 имеетна аминокислотномуровне приблизительноодинаковоеи не оченьзначительноесходство сшироким спектромС-областейL-цепей ИГ хрящевыхи костистыхрыб (41-44%). На нуклеотидномуровне наиболееблизкимигомологамиВ1С гена являютсягены III классахрящевых рыб(65%).
АНАЛИЗГЕНОМНОЙОРГАНИЗАЦИИ
Геномнуюорганизациюлокуса геновL-цепей ИГ стерлядиоценивалиметодом Саузернблот гибридизации.Геномную ДНКвыделяли изпечени стерляди.ДНК расщеплялиэндонуклеазамирестрикцииPstI и PvuII. После электрофоретическогоразделенияи переносафрагментовДНК на нитроцеллюлознуюмембранупроводилигибридизациюв мягких условиях.В качествезонда на V-геныиспользовалифрагмент,полученныйв результатеПЦР (см. КонструированиебиблиотекикДНК и ее скрининг).В качествеС-зонда использовалиучасток кДНКклона В1, кодирующийCLсегмент, которыйвырезали посайтам рестрикцииэндонуклеазамиEcoRV-XhoI.
V-зондвыявлял более20 гибридизующихсяфрагментовДНК, в то времякак С-зондгибридизовалсятолько с 3-4 фрагментами(рис. 13).
5'нетранслируемаяобласть |>лидерный пептид
1 15 30 45 60 75 90
B1 . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCACTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA
E4 CCC----A------- --------------- --------------- ------------------------------ ---------------
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
|>V сегмент FR 1 |> CDR 1
105 120 135 150 165 180
B1 CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCTCTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT
E4 --------------- --------G----T- --------------- ----------. . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
|> FR 2 |> CDR 2 |> FR 3
195 210 225 240 255 270
B1V GGTAATACGTACCTG CACTGGTACCAACAG AAACCTGGAGAAGCT CCCAAACTCCTGATCTATAGGGCAAGTACC CTTGAGTCTGGGATC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . ---- ---C-----------
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . .------------ -----------A------TAT----T--AG ---C-------N---
285 300 315 330 345 360
B1 CCAACTCGTTTCAGT GGCAGTGGATCTGGG ACTGACTTCACTCTG ACCATCAGTGGAGTCCAGGCTGAAGATGAA GGAGATTACTACTGT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------C----C- --------------- --------------- ------------------------------ --------T------
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
PCR --------------- ------------TT- --------------- ----------------------------C- ---------------
|>CDR 3 |> J сегмент |> С сегмент
375 390 405 420 435 450
B1 GTCAGTGTACACTAC TCCAGCAGTAGATAT GTGTTGACTTTCGGG CCCGGGACCAAACTAATTGTGAAATCTGGA AGCCCCACTGCTCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 CAG---TC------- C----------C-G- -NCC-C--------A --A--------G--GG-------------- -A-------------
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
PCR CAG---CAC---ACT C---ATG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
465 480 495 510 525 540
B1 TCCTCCGTCTCCCTG CTTCCTCCCTCCAAG CTGGAGCTCGACTCA AAGGGTAAAGCCACCCTGGTCTGCCTGGTG AATAATTTCTACCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------- ------------A-- -----C---------TG------------- --------------C
C2(T3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -C---------T-------------- --------------C
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
555 570 585 600 615 630
B1 GATGTCGTGGATATC AAGTGGACGGTGGAC GGGGTGGCCCAGTCG TCTGGTGTGCTGACCAGCACAATGAAGCAG AAGGATGGGAAATAC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------T ----C---------- ------------------------------ -----C---------
C2(T3)--------------- --------------T ----C---------- ------------------------------ -----C---------
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
645 660 675 690 705 720
B1 AGTGCAAGCAGCAGC CTGACCCTCACCAAG GCCGTGTGGAACAGC AAGGAGACATACACCTGCACTGTGAAGCAC GAGGCTGTGAGCACT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------- -A------------- ------------------------------ ---------------
C2(T3)--------------- --------------- -A------------- ------------------------------ ---------------
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .
|>3' нетранслируемаяобласть
735 750 765 780 792
B1 CCCAGGAGCGAGTCC ATCAAGAGGAGCGAG TGCACACTATTAGAT GCCtaaAGG . . . .. . . . .
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .
C2 --G----------T- --------------- --------------- ---taaG-CAAGAGAATCCGTGTGATT
C2(T3)--G----------T- --------------- --------------- . . . . . . . . . . .. . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .
Рис.11. НуклеотиднаяпоследовательностьполноразмернойкДНК клона В1и частичнаяпоследовательностькДНК клоновЕ4 и С2 и продуктаПЦР. ПоследовательностькДНК клона С2определяласьс использованиепраймеров V1, V2,C1 (обозначениеС2) и Т3 (обозначениеС2(Т3)). Прочеркозначаетидентичностьв этой позициис кДНК клонаВ1, FR - каркасныеучастки, CDR -гипервариабельныеучастки V области.
A
AruIgLBV QYTVTQTPAEKSVLPGDTVALNCKVNSAVLGNTYLHWYQQKPGEAPKLLIY*RASTLESGIPTRFSGSG**SGTDFTLTISGVQAEDEGDYYCVSV
IpuIgLVG -V-------V--A---E--TI--RT-P-Y*-H*-----------------K*F-NQ-H----A------**--S----------T--A-----Q-Y 71%
OmyIgLV1 -I------EM-AFQT--A-T-R-RF-KPSPPC**VA-------G--Q----*Y-T--Q--T-S------**--S-------------A-----Q-Y 63%
XIaIgLVR -VVL--S-DYV--S--E--TIT--AS-SS---**-------S-QT------*GT-NRYT-T-E------**----------RME---AA----QQY 58%
RabbitkV IV ivm----ss---pv----ti--qasqs-ys-nr-a-f-----qp------*k----a--v-s--k---**---q------d--ca-aat---rva 57%
GciIgLVIII -M--S-PVL--GL-Q--TIT-TASQS-YS-**-A----RE-QK-S----*A-TNRYTEVSE------**---S-----RN--P--VA----QGT 48%
HulV2 -SAL--*-ASV-GS--QSITIS-TGT-SSYNL**VS----H--K----M--*EG-KRP--VSN-----K**--NTAS--T--L-----A----C-Y 47%
HfrIgLVII GTVL--*--SM-TSQ-K--KIT-TISGGGTYY**SS--W----S--VFVWRDYD--RG----D--T--RNT-SNVMH---TD--SR-TA-----AW 41%
XlaIgLIII -VSI--*-VSE--KL-E--RIS-TLSG-SGYH**VN-----A-NR-RY-LRFYSDSNK**HQD-----KDSPNNIGY---K-ALL--DA----ATW 35%
HfrIgLV1 VPVLN---ISDP-SA-E-SE-K-AMQNGGSYY**MS--R-R-----VFVL**YQ--SG-IYRD--KP-RDT-SNSHI---GSLEPG-SAV---AAN 31%
Б
AruIgLCB GSPTAPSSVSLLPPSKLELDSKGKATLVCLVNNFYPDVVDIKWTVDGVAQSSG*VLTSTMKQK**DGKYSASSSLTLTKAVWNSKETYTCTVKHEAVSTPRSESIKRSECTLLDA
CplIgLCII -RS*PT--V----SDQITA-NM-------SG-V-GAAE-E-----SVRGN-*-E--RIQ-EA*-NTF-V--Y---SASD---H-L-S-V-K-ETQAN-LQT--S--S-M 44%
HfrIgLCIII EKSQPTLT-M---PE-VKA--T------ADH----E-GVE-KK--A-I-A-*-Q--NYLRAS*-ST--C--L---SGSD-E-NARFS-ALT-ETL-S-L-K-VS----V 42%
IpuIgLCF G--VKP-----L--S-Q-S*E-S-S-L--LPAYS-QGALVS-----SEVKD-*----AEER-**TDG-TR--T---S--L-EKG-EFV-K-S-DN-DH-VT**FRK-Q-EV 41%
Hukappa TV-AP-VFIF---*D-QLKS-T-SV---L-----REAKVQ-K--NAL--GN*SQE-VTE-DSK-ST--L--T---S--DYEKHKV-A-E-T-QGL-S-VTK-FN-G-- 39%
XlaIgLC3 GDVK--*---YF---*V-EIATK---V--SLSD-T-RGATVK-L---KD-TDS*-QS-GLSKQS*-NL-ME--Y-S--ADQ-LRH---S-K-S-Q**GKEIIQTL-----V 38%
Hulambda1 Q-K-NPT-T-F---*S-ELQAN-------ISD---GA-TVA-KA--SPVKA-*-E-TKPSKQS*NN--A---Y-S--PEQ-K-HRS-S-Q-T-E**GSTVEKTVAPT--S 37%
HfrIgLCI SEDRKP-VL-----*S-EIDS-W---S---SR-K-GF-RVL-R--DKETD--*-T-G-VSTDS*-QS--L--YLRVPATA--KGSS---S-D-GSL-S-LLKT-SSTA-SD 37%
XlaIgLCS ND-KPA-FIFK--*D-QVKE-NP-A---I---F-RDLTVT-K--SQDV--SD-K--DFM-ES*-ST--Q--M-T---DK-DKADKFE-L-K-K**TAQLTQSFSK-Q-S 34%
IpuIgLCG LTQP--TV----SV--Q*QE-V-----AYKGF-SDWRLS-K---SSW---*ESR-SAVLQA*--L--W--T-S-HPEQ-RN-*VV--EASKDN*QP-VVSTVNTEQ- 33%
Рис.12. СравнениеаминокислотныхпоследовательностейV (А) и С (Б) областейL-цепи ИГ стерлядис последовательностямидругих видовпозвоночных.Дефис обозначаетидентичностьв данной позиции.Звездочкаобозначаетделецию аминокислотныхостатков. Слевауказаны процентысходства. Видовыеобозначения:Aru - стерлядь, Ipu -пещерный сомик,Omy - радужнаяфорель, Xla - шпорцеваялагушка, Gci -акула-нянька,Hu - человек, Cpl -песчаная акула,Hfr - разнозубаяакула.
Рис.13. Саузерн блотгибридизация.Геномная ДНКбыла выделенаиз печени иобработанаэндонуклеазамирестрикцииPstI PvuII. Гибридизациюпроводили вмягких условияхс использованиемзондов, гомологичныхVL(а) и CL(б) генным сегментамL-цепей ИГ стерляди.С V-зондомгибридизовалосьболее 20 фрагментовДНК, в то времякак с С-зондомгибридизовалосьтолько 3-4 фрагмента.
ОБСУЖДЕНИЕРЕЗУЛЬТАТОВ
Врезультатепроведеннойработы идентифицированлокус генов,кодирующихL-цепи ИГ стерляди,представителяподклассакостно-хрящевыхрыб. Сравнительныйанализ структурыV генов этоголокуса указывает,что он относитсяк каппа типу.Результатысравнительногоанализа Собластей менееинформативны,что само посебе не удивительно,так как С-геныL-цепей ИГ значительноменее консервативнычем V-гены. Темне менее, тотфакт, что нануклеотидномуровне С-генстерляди имеетнаибольшеесходство скаппа-подобнымигенами III классахрящевых рыб,также свидетельствуето том, что обнаруженныйлокус относитсяк каппа типу.
кДНКклонов В1, С2, Е4,а также фрагмент,полученныйс помощью ПЦР,содержатблизкородственныеV-гены. Различиямежду нимисконцентрированыв основномв области 3-гогипервариабельногорайона. Последовательностидвух обнаруженныхJ-сегментовотличаютсяпо 10 нуклеотидам,т.е., они представляютсобой различныегеномныесегменты.Незначительныеразличия обнаруженытакже междутремя последовательностямиС-генов. С-сегментклона В1 отличаетсяот полногоС-сегментаклона С2 по 9позициям, изкоторых 5 ведутк замене аминокислоты.По-видимому,эти последовательститакже представляютсобой разныезародышевыегены.
Анализструктурнойорганизациилокуса с помощьюСаузернблот-гибридизацииуказывает,что у стерлядиимеются множественныеVLгены. Точнаяоценка ихколичестваневозможна,но наличиеболее 20 полосгибридизациис разной интенсивностьюсигнала, поаналогии смногочисленнымилитературнымиданными, позволяетговорить онесколькихдесятках копий.
ПрииспользованииС-зонда количествополос в мягкихусловияхгибридизациине превышает4-х. Учитываявозможностьаллелизмаможно говоритьо наличии вэтом локусе2-4х генов.
ЯрковыраженноеколичественноепревосходствоV генов надС-генами являетсяхарактернымпризнакомсегментарнойформы организациилокуса. У хрящевыхи костистыхрыб с кластернойорганизациейгенов L-цепейколичествоV и С генов оченьвелико и приблизительноодинаково,что отражаетсяв сходной картинеблот-гибридизации.Полученныенами результатыявляются серьезнымоснованиемдля того, чтобыутверждать,что у стерлядиорганизациягенов L-цепейкаппа-подобноготипа имеетсегментарныйхарактер, подобныйорганизациикаппа локусамлекопитающих.
Этиданные указываютна то, что переходот кластернойк сегментарнойорганизациипроизошел вфилогенезепозвоночныхочень рано,возможно ужеу древнихпервично-костных.
ВЫВОДЫ
1.СконструированабиблиотекакДНК лейкоцитовстерлядипредставительностью6х106независимыхклонов. ПЦР ДНКбиблиотекис помощьювырожденногопраймера,соотвествующегоJ сегментугенов ИГ, позволилвыявить фрагментДНК длиной 370пн, гомологичныйV генам ИГпозвоночных.
2.Из библиотекикДНК с использованиемпродукта ПЦРв качествезонда выделенопять клонов,содержащихвставки кДНКгенов L-цепейИГ. Сравнительныйанализ первичнойструктуры кДНКклонов показал,что они являютсячленами одногосемействагенов и имеютнаибольшеесходство сгенами каппатипа.
3.Согласнорезультамгеномногоблот-анализаидентифицированноесемействосодержит несколькодесятков V генови только 2-4 С гена,что указываетна сегментарнуюформу егоорганизации.
4.Полученныеданные указываютчто переходот кластерноготипа организациигенов ИГ, характерногодля хрящевыхрыб, к сегментарному,присутствующемуу всех млекопитающих,произошел вэволюции впериод появленияпервично-костныхрыб.
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ
МазинА. В., КузнеделовК. Д. и др. Методымолекулярнойгенетики игенной инженерии.Новосибирск,1988. 333 с.
МаниатисТ., Фрич Э., СэмбрукД. Молекулярноеклонирование.М.: Мир, 1984. 480 с.
ПолУ. (ред.) Иммунология.М.: Мир, 1987. Т. 1. 476 с.
РомерА. С. и ПарсонсТ. С. Анатомияпозвоночных.М.: Мир, 1992. 358 с.
ФримельГ. (ред.) Иммунологическиеметоды. М.: Медицина,1987. 472 с.
ЮдкинИ. И. Ихтиология.Москва-Ленинград:Пищепромиздат,1941.
AguileraR. J., Akira S., Okazaki K.,Sakano H. A pre-B cell nuclear proteinwich specifically interacts with the immunoglobulin V-J recombinationsequeces // Cell. 1987. V. 51. P. 909-917.
AndersonM. K., Shamblott M. J., Litman R. T., Litman G. W. Generation ofimmunoglobulin light chain gene diversity in Rajaerinaceais not associated with somatic rearrangement, an exception to acentral paradigm of B cell immunity // Journal of ExperimentalMedecine. 1995. V. 182. P. 109-119.
BengtenE. The immunoglobulin genes in Atlantic cod (Gadusmorhuna)and rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)// Dissertations from the Faculty of Science and Technology. 1994. V.19.
BengtenE., Leanderson T., Pilstrom L. Immunoglobulin heavy chain cDNA fromAtlantic cod (GadusmorhunaL.): nucleotide sequences of secretory and membrane form show anunusual splicing pattern // European Journal of Immunology. 1991. V.21. P. 3027-3033.
BlombergB., Tonegawa S. DNA sequences of the joining regions of mouse llight chain immunoglobulin genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982.V. 79. P. 530.
BoyleJ. S., Lew A. M. An inexpensive alternative to glassmilk for DNApurification // Trends in Genetics. 1995. V. 11. No. 1. p. 8.
ChomczynskiP. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analyticalbiochemistry. 1987. V. 162. P. 156-159.
DaggfeldtA., Bengten E., Pilstrom L. A claster type organization of the lociof the immunoglobulin light chain in Atlantic cod (GadusmorhunaL.) and rainbow trout (OncorhynchusmykissWalbaum) indicated by nucleotide sequences of cDNAs and hybridizationanalysis // Immunogenetics. 1993. V.38. P. 199-209.
DieffenbachC. W. and Dveksler G. S. (edit). PCR primer. A laboratory manual. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. 714 p.
DurdikJ., Moore M. W., Selsing E. Novel klight-chain gene rearrangements in mouse llight-chain-producing B limphocytes // Nature. 1984. V. 307. P.749-752.
FlajnikM. F. The immune system of ectothermic vertebrates // VeterinaryImmunology and immunopathology. 1996. V. 54. P. 145-150.
GhaffariS. H. and Lobb C. J. Structure and genomic organization ofimmunoglobulin light chain in the channel catfish // The Journal ofImmunology. 1993. V. 151. P. 6900-6912.
GilbertW. Evolution of antibodies: the road not taken // Nature. 1990. V.320. P. 485.
GreenbergA. S., Steiner L.,Kasahara M., Flajnik M. F. Isolation of aimmunoglobulin light chain cDNA clone encoding a protein resemblingmammalian klight chains: Implications for the evolution of light chains // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10603-10607.
HaireR. N., Ota T., Rast J. P., Litman R. T., Chan F. Y., Zon L. I.,Litman G. W. A third Ig light chain gene isotype in Xenopuslaevisconsists of six distinct VL families and is related to mammalian lgenes // The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 1544-1550.
HesseJ. E., Lieber M. R., Mizuuchi K., Gellert M. V(D)J recombination: thefunctional difinition of the joining signals // Genes Dev. 1989. V.3. P. 1053-1061.
HieterP. A., Hollis G. F., Korsmeyer S. J., Waldmann T. A., Leder P.Clastered arrangement of immunoglobulin lconstant region genes in man // Nature. 1981. V. 294. P. 536.
HieterP. A., Maizel J. V., Leder J., Leder P. Evolution of humanimmunoglobulin kJ region genes // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 1516.
HohmanV. S., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Complete sequence of a cDNAclone specifying sandbar shark immunoglobulin light chain: Geneorganization and implications for the evolution of light chains //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 276-280.
HohmanV. S., Schuchman D. B., Schluter S.F., Marchalonis J. J. Genomicclone for sandbar shark llight chain: Generation diversity in the absence of rearrangement //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9882-9886.
HsuE., Lefkovits I., Flajnik M., Pasquier L. D. Light chainheterogeneity in the amphibian Xenopus // Molecular Immunology. 1991.V. 28. P. 985-994.
immunoglobulingenes and the antibody repertoire // Molecular Biology Evolution.1993. V. 10(1). P. 60-72.
LitmanG. W., Rast J. p., Shamblott M. J., Haire R. N., Michele H., RoessW., Litman R. T, Hinds-Frey K. R., Zilch A., Amemiya C. T.Phylogenetic diversification ofLobb C. J., Olson M. O. J., Clem W.L. Immunoglobulin light chain classes in a teleost fish // TheJournal of Immunology. 1984. V. 132. P. 1917-1923.
LundqvistM., Bengten E., Stromberg S., Pilstrom L. Ig light chain gene in thesiberiah sturgeon (Acipenserbaeri)// The Journal of Immunology. 1996. V. 157. P. 2031-2038.
MaiseyJ. G. Chondrichthyan phylogeny: a look at the evidence // J. Ven.Paleont. 1984. V. 4. P. 359-371.
RastJ. P., Anderson M. k., Ota T. Litman R. T., Margittai M., ShamblottM. J., Litman G. W. Immunoglobulin light chain class multiplisity andalternative organizational form in early vertebrate philogeny //Immunogenetics. 1994. V. 40. P. 83-89.
ReynaundC. A., Anquenz V., Grimal H., Weill J. C. A hyperconversion mechanismgenerates the chicken light chain preimmune repertoire // Cell. 1987.V. 48. P. 379-388.
RoittI., Brodstoff J., Male D. Immunology. London: Mosby-Year Book Europe,1993.
RomerA. S. Vertebrate Paleontology. Chicago: University Chicago Press,1966.
SakanoH., Huppi K., Heinrich G., Tonegawa S. Sequences at the somaticrecombination sites of immunoglobulin light-chain genes // Nature.1979. V. 280. P. 288.
SakanoH., Maki R., Kurosawa Y., Roeder W., Tonegawa S. Two types of somaticrecombination are necessary for the generation of completeimmunoglobulin heavy-chain genes // Nature. 1980. V. 286. P. 676.
SangerF., Niklen, S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1977. V. 74. P. 5463-5467
SchatzG. D., Oettinger A. M., Schlissel M. S. V(D)J recombination:molecular biology and regulation // Annual Review of Immunology.1992. V. 10. P. 359-383.
SchwagerJ., Burckert N., Schwager M., Wilson M. Evolution of immunoglobulinlight chain genes: analysis of Xenopus IgL isotypes and theircontribution to antibody diversity // The EMBO Journal. 1991. V. 10.P. 505-511.
SeidmanJ. G., Max E. E., Leder P. A. A kimmunoglobulin gene is formed by site - specific recombinationwithout further somatic mutation // Nature. 1979. V. 280. P. 370.
ShamblottM. J. and Litman G. W. Genomic organization and sequences ofimmunoglobulin light chain genes in a primitive vertebrate suggestcoevolution of immunoglobulin gene organization // The EMBO Journal.1989. V. 8. P. 3733-3739.
ShankeyT.V. and Clem L.W. Phylogeny of immunoglobulin structure andfunction. IX. Intramolecular heterogeneity
ofshark 19S IgM antibodies to the dinitrophenyl hapten //
J.Immunol. 1980. V. 125. P. 2690-2698.
StavnezerJ., Kekish O., Batter D., Grenier J., Balazs I., Henderson E., ZegersB. J. Aberrant recombination events in B cell lines derived fromk-deficienthuman // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. P. 3495-3514.
StewartS. E., Pasquier L. D., Steiner L. A. Diversity of expressed V and Jregions of immunoglobulin light chains in Xenopuslaevis// European Journal of Immunology. 1993. V. 23. P. 1980-1986.
StrobU. Transgenic mise with immunoglobulin genes // Annual Review ofImmunology. 1987. V. 5. P. 151-174.
ThompsonG. B. and Neiman P. E. Somatic diversification of the chickenimmunoglobulin light chain gene is limited to the rearranged variablegene segment //Cell. 1987. V. 48. P. 369-378.
TonegawaS. Somatic generation of antibody diversity // Nature. 1983. V. 302.P. 575-581.
UdeyJ. A., Blomberg B. Human llight chain locus: organization and DNA sequences of three genomic Jregions // Immunogenetics. 1987. V. 25. P. 63.
WaiLin Tung, King-C. Chow. A modified medium for efficientelectrotransformation of E.coli // Trends in Genetics. 1995. V. 11.No. 4. Р. 128-129.
WilsonM., Hsu E., Marcuz A., Courent M., Pasquier L. D., Steinberg C. Whatlimits affinity maturation of antibodies in Xenopus: the rate ofsomatic mutation or the abilityto select mutants? // The EMBOJournal. 1992. V. 11. P. 4337.
ZezzaD. J., Mikoryak C. A., Schwager J., Steiner L. A. Sequence of Cregion of L chains from XenopuslaevisIg // The Journal of Immunology. 1991. V. 146. P. 4041-4047.
ZezzaD. J., Stewart S. E., Steiner L. A. Genes encoding XenopuslaevisIg L chains. Implications for the evolution of kand lchains // The Journal of Immunology. 1992. V. 149. P. 3968-3977.
МИНИСТЕРСТВООБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯРФ
НОВОСИБИРСКИЙГОСУДАРСТВЕННЫЙУНИВЕРСИТЕТ
ФАКУЛЬТЕТЕСТЕСТВЕННЫХНАУК
Кафедрацитологии игенетики
КЛОНИРОВАНИЕИ АНАЛИЗ ГЕНОВЛЕГКИХ ЦЕПЕЙИММУНОГЛОБУЛИНОВСТЕРЛЯДИ
Дипломнаяработа
ДенисоваС. Г.
_____________
Научныйруководитель
к.б.н.Таранин А. В.
_____________
Работавыполнена в
лабораториииммуногенетики
Институтацитологии и
генетикиСО РАН.
Новосибирск1997