3. Электрокардиография
4. Фетоскопия
5. Биопсия
1) амниона
2) плаценты
3) плода
Б. Косвенные (материнские)
1. Кровь, например, лимфоциты плода.
2. Моча, например, экскреция эстриола.
Так, было установлено, что в материнском кровотоке имеется небольшое количество лимфоцитов, содержащих ХУ половые хромосомы, если развивается плод мужского пола. Какое значение имеют эти данные и могут ли они быть использованы в дородовой диагностике, еще не известно. Изучение продуктов обмена веществ в моче матери уже можно рассматривать с точки зрения их ценности в дородовой диагностике.
Методы исследования непосредственно плода включают рентгенографию для установления патологии скелета, амниографию, при которой контрастный материал вводится в амниотическую полость и очерчивает плаценту и мягкие ткани плода, и фетографию, когда используется контрастное вещество, имеющее сходство с vernix caseosa, и поэтому очерчивающее мягкие ткани плода. Такие методы, как сонография, с помощью которой можно также установить врожденные нарушения, и элекардиография плода, которая может быть использована в диагностике врожденной блокады сердца in utero, оказываются полезными только в поздние сроки беременности. Фетоскопия – новый прием, который позволяет производить раннее определение врожденных аномалий. Возможность биопсии амниотических оболочек или плаценты находится еще на этапе экспериментального изучения.
Наиболее широко исследуются амниотическая жидкость и содержащиеся в ней клетки, получаемые путем амниоцентеза обычно через переднюю брюшную стенку. Эта книга касается почти исключительно результатов подобных исслндований, направленных на дородовую диагностику наследственных болезней.
Создание методов молекулярной диагностики на уровне генных мутаций было революционным прорывом в области обще и прикладной генетики. Классической основой современных молекулярно-генетических методов стала технология блот-гибридизации по (1975).
Основными методическими приемами, используемыми при молекулярной диагностике, являются: получение (клонирование) зондов фрагментов ДНК с точно установленными нуклеотидными последовательностями и меченых радиоизотопами или флуоресцирующими соединениями; разрезание исследуемой молекулы ДНК (больного) на фрагменты с помощью ферментов – рестриктаз; электрофоретическое разделение полученных фрагментов в геле; гибридизация исследуемых и разделенных в электрическом поле фрагментов и меченого ДНК-зонда; перенос гибридных фрагментов из геля на целлюлозу (что достигается путем “промокания” блоттинга) (to blot по - английски – промокать) количественный анализ интенсивности зон гибридизации методом аутодиографии или измерения флуоресценсии.
Так как количество доступной для анализа ДНК может быть очень велико (например ДНК, выделенной из клеток амниотической жидкости или всего лишь из одной клетки), выход был найден, благодаря разработке полимеразной цепной реакции (polymerase chain rection или PCP), которая позволяет получить множество – до 1000 копий единственной молекулы ДНК. Это позволяет производить молекулярную диагностику на ДНК, полученной даже из единственной клетки эмбриона или выделенной из сперматозоида.
При ДНК – диагностике наследственнных болезней используются различные подходы, в зависимости от того, известен или неизвестен ген, с мутацией которого связано заболевание, известен ли ее харакер. В тех ситуациях, когда ген известен, установлена молекулярная природа мутации, возможна прямая ее идентификация с помощью соответствующего зонда ил пробы *они должны включать известную мутацию, чтобы произошла гибридизация зонда с исследуемой ДНК).
При ДНК – диагностике неизвестных генных мутаций исследуется семейное распределение рестикционных фрагментов или полиморфизм дляны рестикционных фрагментов (ПДРФ). Такой полиморфизм является хорошим генетическим маркером наследования болезни. Об этом говорилось выше.
При ДНК – диагностике болезней, при которых неизвестен ни ген, ни первичный биохимический дефект, также исследуется полиморфизм длин рестрикционных фрагментов и осуществляется анализ сцепления определенных фрагментов ДНК с признаками болезни.
За последние годы на основе анализа сцепления удалось картировать (т.е. установить локализации на хромосомах) гены многих заболеваний – синдромов Марфана, Элерса – Данлоса, нейропатии Шарко – Мари и многие другие. Созданы ДНК – диагностикумы для ряда аутосомно – рецессивных (муковисцидоз, фенилкетонурия, талассемия) и аутосомно – доминантных заболеваний (миотония Штейнерта, нейрофиброматоз Реклингхаузена и др.). Стала возможной прентанальная диагностика и выявление гетерозиготного носительства мутантных генов – ПМД Дюшенна, муковисцидоза, синдрома Леш – Найена, поликистоза почек, ретинобластомы, хореи Гентингтона.
В то время как частота инфекционных заболеваний уменьшается и улучшаются факторы внешней среды, возрастает относительная роль генетических болезней как причины смертности и заболеваемости. Например, Картер (1963) показал, что за последние 70 лет частота врожденных аномалий как причина смертности новорожденных увеличилась приблизительно с 5 до 20%, а Робертс, Чавес и Курт (1970) обнаружили, что среди причин гибели детей в больнице свыше 40% были генетическими или частично генетическими. Общая частота генетических болезней у новорожденных обычно около 3-5%. В дополнение имеется много общих семейных болезней, таких, как шизофрения или диабет, которые проявляются позднее в течение жизни.
При анализе генетического заболевания важно помнить не только о разнообразии, о типах его наследования, но и о тяжести, возрасте, при котором оно начинает проявляться, его продолжительности и отягощении для индивидуума и общества. На основании этих данных составляют план профилактических мероприятий. Тяжелая болезнь плода, сопровождающаяся смертью при рождении, как, например анэнцефалин, влечет небольшую отягощенность обществу или семье. С другой стороны, если пораженные индивидуумы выживают и нуждаются в продолжительном уходе и лечении, как при spina bifida, состояние характеризуется значительной отягощенностью для окружающих таких больных людей и становится дорогостоящим для общества. Если дефект может быть исправлен хирургически, как при трещине губы (с наличием трещины или без нее), то расходы при этом невелики, но некоторые косметические дефекты остаются у индивидуума на всю жизнь. При тяжелых заболеваниях, выводящих из строя, таких, как мышечная дистрофия Дюшенна и синдром Дауна, отягощенность для индивидуума и семьи, расходы невелики, если ребенок остается дома, и значительны, если он помещается в лечеюное учереждение. Аналогично сказанному тяжесть поздно проявляющихся болезней таких, как хорея Гентингтона и шизофрения, вызывающих значительные отягощения для пораженных индивидуумов, одинакова для их семей и общества.
§5.2. Степень риска
Основной статистический показатель в дородовой диагностике – степень риска поражения плода. Этот показатель может определить, есть ли медицинские показания для дородовой диагностики и приемлема ли она для родителей. Во многих случаях степень риска может быть легко получена на основе только знаний типа наследования данного состояния. Однако же для простых менделирующих состояний степени риска могут быть не всегда точно установлены. Для оценки риска неменделирующих состояний может быть использован эмпирический подход, но имеются новые способы для сочетания эмпирического подхода и анализа родословной, чтобы измерить степень специфического риска для каждой обследуемой мемьи.
§5.3. Аутосомные нарушения
Традиционно установленная степень риска в 25 и 50% обычно относится соответственно у рецессивным и доминантным состояниям. Однако могут быть отклонения из-за наличия генетической гетерогенности, неполной пенетрантности, фенокопий, начала болезни в различном возрасте, случаев мутаций и скрещиваний пораденных родителей. Общая проблема, которая возникает в анализе поздно проявляющихся доминантных состояний, состоит в том, что неизвестно, нормален ли индивидуум, имеющий пораженного родителя, или болезнь у него еще проявится. Возможность быть носителем можно установить по графику, на котором показано, как распределяется в популяции возраст, характерный для начала болезни.
§5.4. Нарушения, сцепленные с Х-хромосомой.
Если мать знает, что является носителем нарушения, сцепленного с Х-хромосомой, риск появления пораженного сына, конечно, 25%. Однако, если статус матери сомнителен, предсказать степень ее риска может быть очень сложно. Сведения из родословной (включая данные о нормальных мужчинах) и о каких-либо носителях, обнаруженных среди женщин-родственниц, могут позволить более точно измерить степень риска. Мерфи (1969) показал, как методы Беезина могут быть использованы для вычисления степени риска, в 1970 году он формализовал методы в вычислительную систему ENSU (Equivalent Normal Son Unit – эквивалентный показатель нормального сына). Могут быть также использованы сведения о биохимических исследованиях матери–носителя и других женщин-родственниц, а формулы и графики полезны для вычисления степени риска летальных состояний, сцепленных с Х-хромосомой.
Очевидно, что дородовая диагностика имеет значительные возможности в предупреждении генетического заболевания как в отдельных семьях, так и в популяции в целом. В настоящее время ее использование ограничено, а ее влияние небольшое, но так как исследования углубляются, и создаются новые методики для дородовой диагностики большого количества генетических болезней, она может быть использована шире, и ее влияние на генетические болезни может увеличиться.
Важно, что клиницисты установили природу и степень любых рисков, вызванных различными методами и способами дородовой диагностики, так что теперь можно определить только воздействие этой процедуры на здоровье. Регистр амниоцентеза уже создан.