Нейтрофилы (стр. 3 из 7)

В 1962 году Boyden разработал метод количественной оценки подвижности популяции нейтрофилов. Метод заключается в миграции лейкоцитов через тонкий фильтр, который разделял камеру на два отсека. В верхний отсек помещали суспензию клеток, клетки оседают на фильтр и переходят через поры в нижний отсек. Размер пор для нейтрофилов 3 мкм, для эозинофилов 5 мкм, для макрофагов 8 мкм. Чтобы оценить хемотаксис нейтрофилов, нужно нижний отсек заполнить раствором содержащий хемоаттрактант. Этот метод эффективен в оценке хемотаксиса, но не случайного блуждания т.к. движение лейкоцитов не является свободным. Недостаток этого метода в том, что он не позволяет наблюдать клетки в процессе движения, а оценка двигательной активности по самым подвижным клеткам популяции.

В 1975 году был изобретен новый метод исследования подвижности под агарозой. Чашки Петри заполняются горячим раствором агарозы в физиологическом растворе. При застывании раствора образуется гель, в котором проделывают лунки до дна чашки, а в лунки помещают суспензию клеток. Клетки начинают двигаться через лунки на дно чашки Петри под гель, по радиусу разбегания оценивается свободное блуждание. Если надо исследовать хемотаксис, то рядом с первой лункой делают ещё одну, в которую помещают раствор хемоаттрактанта. Агарозный гель полупрозрачен и можно наблюдать через микроскоп за живыми клетками. Недостаток метода является длительное время инкубации для получения картины разбегания клеток из лунки.

При использовании методов, описанных выше, необходимо проводить дополнительные исследования для различения случайного блуждания, хемотаксиса или хемокинеза. Такие методы исследования не дают возможности изучать отдельные клетки во время движения.

В 1953 году Харрис впервые использовал автоматический метод съемки движущихся нейтрофилов. Этот метод был использован в клинических исследованиях.

Полностью автоматизированные методы появились, когда были решены проблемы оптического выделения объектов и были созданы программы слежения за движущимися клетками (Туманов и соавт. 1990). В исследовании подвижности нейтрофилов важен выбор межкадрового интервала. В экспериментах (Hartoman R. S. el al 1994), средняя скорость движения при интервалах регистрации 4 сек. была 17 мкм/мин., а при интервалах 36 сек, составляла 9.9 мкм/мин. Отличие связано с тем, что размер нейтрофила составляет 10 мкм, а время нужное на перемещение равное клеточному диаметру приблизительно равно 1-1.5 минут. Поэтому для оценки внешнего движения используют 1 минутный межкадровый интервал, нейтрофилы за этот интервал времени перемещаются в среднем на величину клеточного диаметра. Такая регистрация позволяет оценить воздействие химических и физических факторов на подвижность нейтрофилов, проводить сравнение в норме и патологии.

Регистрация внутреннего движения используется для более подробного исследования изменений подвижности. Для этого выбирается межкадровый интервал такой, чтобы при непрерывном измерении перемещение центра массы клетки, связанное с изменением формы клетки за время межкадрового интервала не превышало клеточного диаметра (Hartman R. S. Lau K. Chou. W. Coates T. D. 1994).

Анализ траекторий случайного блуждания клеток, которые регистрируют с интервалом 2 сек. показывает, что поведение клеток отличается на малых и больших временах наблюдения. По степени корреляции разделяют два вида траектории движения:

1. Персистентное движение – клетка некоторое время пытается сохранить величину и направление движения.

2. Диффузионное движение – связано с внутренними процессами в клетке стремящимися изменить направление движения клетки.

Среднее время перехода между этими двумя формами движения называется характерным временем или временем персистентного движения (Tranquillo R.T. at al 1988).

Движение нейтрофилов изучали на покровных стеклах. Движение клеток происходит по определенной траектории, у каждой клетки она своя. Форма траекторий разнообразна, от плотного клубка до расплетенных нитей. Нейтрофилы бывают: медленные, средние и быстрые. Медленные – это клетки, которые вытягивают ламеллоподии в разные стороны, но в результате отсутствия скоординированного двигательного акта они стоят на месте или движутся но очень медленно. Средние клетки имеют траекторию более запутанную в виде плотного клубка из-за того, что они больше стоят на месте и углы поворотов у них больше. Быстрые клетки имеют меньшие углы поворотов и меньше времени стоят на месте, следовательно, их траектория более прямая. Такой вывод был сделан по произвольно выбранным клеткам. Время пребывания в фазе активности и углы поворотов определяются внутренней программой клетки.

Подвижность нейтрофилов может служить показателем тяжести состояния больных с раневой инфекцией.

Табл. 1 Средняя скорость движения и процентный состав нейтрофилов в группах здоровых доноров и больных с раневой инфекцией.

ГРУППЫ	СКОРОСТЬ мкм/мин	МЕДЛЕННЫЕ %	СРЕДНИЕ %	БЫСТРЫЕ %
ЗДОРОВЫЕ	8.8 ± 0.2	16	28	56
СР. ТЯЖЕСТИ	6.5 ± 0.3	27	34	39
ТЯЖЕЛЫЕ	3.3 ± 0.3	58	27	15

У тяжелых больных средние скорости нейтрофилов распределены в диапазоне от 0 до 6 мкм/мин. Такой широкий диапазон средних скоростей из-за того, что больные подвергаются интенсивному лечению (операции, антибиотикотерапия). У больных средней тяжести, скорости распределены в области от 4.5-9 мкм/мин. Ухудшение состояния больного происходит из-за уменьшения клеток в популяции. При тяжелом состоянии средняя скорость в популяции ниже 3 мкм/мин, а скорость 5-6 мкм/сек говорит о том, что состояние средней тяжести.

Нарушение подвижности нейтрофилов было обнаружено у ожоговых больных и больных с острой пищевой токсикоинфекцией. В каждой группе было исследовано по 5 больных. В группу ожоговых больных входили тяжелые больные с площадью ожогов 50% поверхности тела. Группу с острой пищевой токсикоинфекцией составляли больные с тяжелой сальмонеллезной эндотоксимией. У этих больных интоксикация приводит к сильному угнетению подвижности нейтрофилов.

Табл. 2 Скорость движения и процентный состав неподвижных, медленных и быстрых нейтрофилов у ожоговых больных и больных с острой пищевой токсикоинфекцией.

Больные	Ожоги	Пищевая токсикоинфекция
N = 5	Скор. % состав мкм/мин м:с:б	Скор. % состав мкм/мин м:с:б
СРЕДНИЕ	3.2 62:24:14	2.1 75:19:6
ОШ. СРЕДНЯЯ	0.4	0.5

Бактерии способны выделять хемоаттрактанты, которые притягивают нейтрофилы в зону инвазии (способность возбудителей проникать и распространяться в организме). Бактериальные хемоаттрактанты типа формил – пептида при больших концентрациях проявляют эффект «западни» угнетая движение нейтрофилов.

Алгоритм работы модели клетки

В поле зрения микроскопа клетка движется по случайной траектории. Из начального положения клетка может перемещаться на случайное расстояние в отрезке от 0 до r_max, под случайным углом от 0 до ±180⁰.

Случайный шаг характеризуется распределением:

рис. 3 Распределение (частота встречаемости) шагов, на которые клетка перемещается за выбранный промежуток времени (1 минута).

Клетка во время движения может менять как шаги, так и углы поворотов, от 0 до 180⁰. Углы меняются по отношению к предыдущему направлению клетки.

Случайные углы поворота нейтрофилов характеризуются распределением:

рис. 4 Распределение углов поворотов при случайном движении. Углы распределены от 0 до 1800, знак угла считается равновероятным.

Из распределения углов поворота видно, что нулевой угол встречается чаще, следовательно, он наиболее вероятен, а угол 180⁰ наименее вероятен. Из этого следует, что клетка при движении сохраняет свое направление. Углы поворотов распределены от 0 до 180⁰, при этом знак угла считается равновероятным (вправо или влево). В соответствии с такой гипотезой строится алгоритм модели движения клетки.

Нейтрофилы разделены на три типа: быстрые, средние и медленные. Три типа клеток различаются между собой по максимально возможному шагу в единичном акте движения. Для медленных клеток эта величина составляет 3 мкм (величина меньше размера клетки). Для средних клеток – 10 мкм (величина, немного превышающая размер клетки). Для быстрых клеток составляет 30 мкм.

Вычисление координат клетки

Координаты каждой последующей клетки вычисляются из предыдущего. Программа генерирует три случайных числа в соответствии с заданными распределениями (для каждого вида нейтрофилов своё распределение)

r_i - случайный шаг.

j_i - угол поворота.

sign_i - направление поворота.

Вычисляем угол по отношению к оси 0X.