Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки (стр. 4 из 7)
1 - подготовка образца для анализа
Некоторые типы иммуносенсоров способны взаимодействовать непосредственно с биологическим материалом. Однако чаще всего используется предварительно отделенная центрифугированием плазма или сыворотка крови, разведенная специальным раствором.
2 - проведение аналитической процедуры
Помещая каплю раствора на микроэлектрод, или опуская электрод в исследуемый образец, создается контакт реагентов. Время достижения равновесия от нескольких секунд (для низкомолекулярных веществ) до нескольких минут (для высокомолекулярных агентов, антигенов, клеток). Результат определяется по разнице в показаниях с референс-электродом или по изменению сигнала после реакции. Результат может быть выражен в систематических единицах (милливольт, миллиампер), либо с помощью микропроцессора трансформирован в единицы концентрации искомого агента, в соответствии с предварительным калиброванием.
3 - регенерация иммуносенсора
Для повторного или многократного использования иммуносенсора необходимо освободить его рабочую поверхность от веществ, активно или пассивно сорбированных в ходе анализа. Наиболее простой способ регенерации состоит в интенсивном последовательном промывании иммуносенсора раствором с кислым значением рН и буферным раствором с высокой ионной силой. Для некоторых типов иммуносенсоров до сих пор не найдено оптимальных условий регенерации, не снижающих их чувствительность. В этих случаях используют сменные одноразовые мембранные элементы.
В ближайшее время будут созданы надежные портативные иммуносенсоры для диагностики наиболее распространенных инфекционных заболеваний, как это сделано уже для анализаторов глюкозы.
МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ
Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной методической базы генетических исследований явились основой генетической инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК, так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации - образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А-Т, Г-Ц). Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально создается, так называемый, зонд полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В его состав вводят специальную метку, позволяющую идентифицировать образование комплекса. Схема реакции представлена на рисунке.
Рис. Схема реакции генного зондирования для обнаружения в образцах ДНК или РНК микроба специфическим меченым зондом.
Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии (вирусы, встроенные в геном, «молчащие» гены).
Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто исследовательскими задачами молекулярной биологии - контролем наличия тех или иных последовательностей ДНК в общем пуле клеточной ДНК. Различают несколько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну (анализ ДНК), Nothern-блот (анализ РНК), точечная гибридизация, гибридизация in situ. (на срезе, в мазке)
Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного микроорганизма), как правило представленные в виде генетических последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда - препараты РНК, особенно часто - рибосомальная РНК [Stull T.1988].
В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотоп (с дальнейшим проявлением комплексом авидин-фермент) и т. п.
Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В исследовательских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором (32Р). В настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты.
В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего - полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК- или РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение метки.
Для подготовки пробы может быть необходимо предварительное «подращивание» исследуемого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличения концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот фиксируют на носителе - нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С0 в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.
После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры. Например, известен метод определения модифицированных участков ДНК с помощью антител [Stollar В., Rashtchian А., 10987], введением в состав зонда низкомолеку лярных компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с последующим проявлением конъюгатом авидин-фермент, антитело - фермент [van Brunt J., Klausner A. 1987].
Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного зондирования появились в 1986 г. - ими стали наборы для определения М.pneumoniae, L.pneumoniae. Затем появились наборы для индентификации других патогенов, в том числе - вируса иммунодефицита человека.
В настоящее время ведутся интенсивные разработки по упрощению процедуры генного зондирования до одной - двух стадий процесса. Предприняты попытки отказаться от сорбции материала на мембране [Edelstein Р., 1986].
Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых - холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация in situ).
Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (РCR). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro. Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНК-полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры - два типа олигонуклеотидов величиной 20-25 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5-3, а второй - копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНК-копий.
Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40-55°С. В первом сообщении, описывающем метод, полимеразу добавляли вновь после каждого взаимодействия праймеров с ДНК, так как фермент не выдерживал нагревания до 940. В настоящее время чаще используют ДНК- полимеразу термофильной бактерии Т.aquaticus, выдерживающую такую температуру и имеющую максимум активности при 7()°С.
Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.
Реакция амплификации позволяет существенно повысить чувствительность анализа при генном зондировании, что особенно важно при низкой концентрации инфекционного агента. Особое значение этот подход приобрел при диагностике СПИДа и некоторых других вирусных инфекций. Причем в этих случаях впервые была показана возможность амплификации и для РНК-содержащих вирусов (непосредственно, или через провирусную ДНК) [Реаkе I., 1989].
Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией является возможность исследования субмикроскопического количества патологического материала. Так уже показана возможность генетического анализа материала единственной волосяной сумки, взятой из человеческой кожи, или нескольких десятков буккальных клеток, полученных простым полосканием полости рта [Lench N. еt аl., 1988].