Новые методы иммунодиагностики и критерии их оценки (стр. 5 из 7)

Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного материала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов. Например, выявление гена холерного токсина в штаммах без его фенотипического проявления, позволяет сделать важные выводы при эпидемиологическом анализе [Гинцбург А. Л., 1988].

Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики инфекционных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.

ИММуноэлектрофорез и ИММУНОБЛОТТИНГ

Иммуноэлектрофорез помогает идентифицировать антигены по электрофоретической подвижности, особенно в том случае, когда в образце присутствуют и другие антигены. С помощью данного метода в клинической иммунологии полуколичественно определяют концентрацию иммуноглобулинов и идентифицируют миеломные белки.

На основе сочетания электрофореза с иммуноперципитацией разработано несколько удачных

методов, в каждом из которых перемещение антигена в электрическом поле приводит к его контакту с антителами. Встречный иммуноэлектрофорез может применяться для определения антигенов, мигрирующих в агаре к положительно заряженному электроду. Данный метод занимает меньше времени и более чувствителен, чем двойная диффузия по Ухтерлони. Его применяют для идентификации антигенов вируса гепатита В и соответствующих антител, антител к ДНК при системной красной волчанке, аутоантител к растворимым ядерным антигенам при коллагенозах, а также антител (преципитинов) к Aspergillus при аллергическом бронхолегочном аспергиллезе. Ракетный электрофорез-это количественный метод, предусматривающий внесение антигена в гель, содержащий антитела. Линия преципитации имеет форму ракеты , длина которой определяется концентрацией антигена. Как и встречный электрофорез, это-быстрый метод, но и здесь антиген должен перемещаться к положительно заряженному электроду. Таким образом, ракетный электрофорез подходит для белков, например альбумина, трансферрина и церулоплазмина, в то время как концентрацию иммуноглобулинов обычно определяют методом простой радиальной иммунодиффузии. Один из наиболее удачных вариантов ракетного электрофореза - двухмерный или перекрестный иммуноэлектрофорез Лорелла. При этом на первом этапе смесь антигенов электрофоретически разделяют в геле агарозы. Затем разделенные белки вновь заставляют диффундировать в геле под влиянием электрического поля в другом

Рис. Виды иммуноэлектрофореза А- простой иммуноэлектрофорез; Б- встречный иммуноэлектрофорез; В - ракетный иммуноэлектрофорез; Г - двумерный иммуноэлектрофорез. Стрелки - направление движение АГ и АТ в электрическом поле.

направлении, перпендикулярном первому. Таким образом удалось количественно определить каждый из антигенов смеси. Наиболее впечатляющий пример- это оценка степени конверсии СЗ в инактивированную форму СЗс, которая часто происходит при обострении в сыворотке больных системной красной волчанкой или синовиальной жидкости пораженных суставов в острой фазе ревматоидного артрита, а также в других случаях.

Иммуноблоттинг

После разделения сложной смеси белков методом электрофореза в полиакриламидном или ага- розном геле их можно перенести из геля на

Рис. Схема иммуноблотинга

микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Далее неспецифически связанные с мембраной антигены могут быть идентифицированы с помощью меченых антител. Данный метод получил широкое распространение. Например, он используется для идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН).

Рис. Пример иммуноблотинга

Разумеется, если антиген необратимо денатурируется ДСН, то такая методика использоваться не может. Если белки антисывороткк разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блоттингом) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

Схема: Основные методы окраски в иммуноблотинге (Western-blot).

КРИТЕРИИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Проблема дифференциации положительного и отрицательного результата не является специфической для медицины, а пути ее разрешения лежат в области математической статистики. Тем не менее, следует обсудить некоторые практические вопросы, с которыми встречаются врачи при использовании различных методов лабораторной диагностики, в том числе - иммунохимического анализа при инфекционных заболеваниях.

Основным противоречием, возникающим при анализе лабораторных данных и приводящим к совершенствованию известных и разработке новых методов диагностики, является несоответствие между целью медицинской диагностики как таковой, т. е. стремлением врача определить, чем болен пациент и целью того или иного метода (установление какого-либо параметра внутренней среды организма). Поэтому любой метод иммунохимического анализа должен рассматриваться лишь как часть общей диагностической процедуры. Ни один из этих методов не может быть использован вне клинической интерпретации. Ложноположительные или ложноотрицательные выя реакции при лабораторном анализе имеют значение не только для самого пациента. Такая ситуация при СПИДе, например, оказалась опасной и в социальном и в эпидемиологическом аспекте.

В лабораторном анализе при характеристике аналитической процедуры принято указывать количественные показатели метода: чувствительность, воспроизводимость, точность и др. Однако при определенных взаимодействиях между организмом и инфекционным агентом может возникнуть ситуация, когда высокочувствительный метод не позволяет получить достоверную информацию о причине заболевания. Например, определение антител любыми совершенными методами не дает информацию в случае выраженной иммуносупрессии гуморального ответа.

Для того, чтобы выразить возможность использования симптома (результата иммунохимического анализа) для диагностики определенного заболевания можно определить понятия чувствительности и специфичности анализа, в сравнении с контрольной группой здоровых людей, как частоту положительных и отрицательных реакций.

число положительных реакций у больных с подтвержденным диагнозом

Чувствительность=---------------------------------------------------------------------

число обследованных больных с подтвержденным диагнозом

число отрицательных реакций в контрольной группе

Специфичность = -------------------------------------------------------------------------

число обследованных пациентов в контрольной группе

Эти параметры могут быть использованы при сравнении эффективности каких-либо методов. Однако для применения их на практике необходимо уточнить принципы формирования опытной и контрольной групп, а также оценить, какое значение имеют вычисленные параметры для оценки случайно выбранных неизвестных образцов. Правильное решение указанных вопросов и позволяет перейти к разработке критериев положительной и отрицательной реакции.

Для формирования опытной группы больных с инфекционной патологией, как правило, используют больных, у которых обнаружен искомый инфекционный агент другими методами - бактериологическими, вирусологическими и т. п. В случае инфекции, вызываемой условнопатогенными микроорганизмами используют количественные или функциональные критерии. В зависимости от целей анализа, группа может быть более или менее однородной по другим признакам данного заболевания - особенностям течения и тяжести инфекционного процесса, возрасту больных, сопутствующему лечению (прежде всего - введению антибиотиков).

Формирование контрольной группы из здоровых лиц является наиболее частым, но не единственным способом. Если анализируемый метод будет применен для дифференциального анализа _ сходных заболеваний, вызываемых разными микроорганизмами, более важным является подбор группы с заболеванием, которое следует исключить при установлении диагноза. Например, при острой пневмонии, вызванной различными возбудителями (Str. Pneumoniae, H. influenzae) для оценки чувствительности и специфичности, например, метода определения антигенов пневмококка, следует сформировать контрольную группу из больных с заболеванием, вызванным гемофильной палочкой. Вышеуказанное важно учитывать при разработке методов диагностики. Однако и при использовании этих методов следует иметь представление о причинах возникновения и возможной интерпретации ложноположительных и ложноотрицательных реакций. При анализе образцов от пациентов с неизвестным диагнозом следует учитывать дополнительные параметры, производные от чувствительности и специфичности анализа.

Ожидаемая ценность Число положительных результатов в опытной группе

положительного =-------------------------------------------------------------------

результата Число положительных результатов в обеих группах

Ожидаемая ценность Число отрицательных результатов в опытной группе

отрицательного =-------------------------------------------------------------------

результата Число отрицательных результатов в обеих группах

В целом, чем выше чувствительность и специфичность анализа, тем выше ценность положительного и отрицательного результатов. Однако для случайно взятых образцов значение ожидаемой ценности результатов будет зависеть от частоты данного заболевания в популяции (преваленс). Например, при чувствительности и специфичности метода равных 99% и частоте заболевания 0,1% количество больных на 100 000 пациентов составит 100, из них положительная реакция будет у 99. Однако у пациентов без данного заболевания (всего их 99 900) будет в 100 случаях также выявлена положительная реакция. Таким образом, ценность положительного результата составит 99/(100+99) 50%, а отрицательного - 99 80ОД99 800+1) 100%. В случае же, если в данной популяции частота заболевания более высока, то и ценность положительного результата выше. Например, при частоте в 10%, соответствующие значения ценности положительного результата - 91,70/0, а отрицательного - 99,9%.