Сорокин Константин Владимирович
Введение
Лейкоцитоспермия, определяемая ВОЗ как концентрация лейкоцитов >1 млн/мл спермы, наблюдается приблизительно у 20% мужчин с бесплодием, но ее влияние на качество спермы не выяснено. В некоторых исследованиях выявлено отрицательное влияние лейкоцитоспермии на качество спермы, в других влияния не обнаружено или наблюдалось даже улучшение качества спермы [1-5]. В последних исследованиях показано, что активные формы кислорода, которые производятся, в частности, лейкоцитами, могут повредить ДНК сперматозоидов [6,7]. Это приводит к важным выводам: большинство мужчин, страдающих бесплодием, сдают сперму для искусственного оплодотворения, и необходимо избежать повреждения сперматозоидов и инфицирования яйцеклетки.
Происхождение лейкоцитов в эякуляте часто остается невыясненным. В основном, они происходят из придатка яичка, так как исчезают после вазэктомии [2], и появляются при инфицировании. Однако, у большинства мужчин, обратившихся в андрологическую клинику по поводу бесплодия, не наблюдалось проявлений инфекции (например, эпидидимита). Кроме того, наличие лейкоцитов слабо коррелирует с присутствием бактерий [8,9]. Бактериоспермия, которая предположительно связана с контаминацией, обнаруживалась более чем в 50% случаев [10] вне зависимости от лейкоцитоспермии. Дезинфекция кожи должна уменьшать количество ложноположительных посевов за счет исключения контаминации энтеральными бактериями [11]. Однако чувствительность определения патогенных бактерий в образцах спермы по критериям ВОЗ составляет лишь 20% [12].
Анализы спермы выполняются различными специалистами (андрологами, урологами, гинекологами, врачами-лаборантами), и критерии ВОЗ не всегда строго соблюдаются. Обычно вместо пероксидазной реакции для оценки количества лейкоцитов используют фазовую микроскопию, или же пероксидазную реакцию используют, если количество лейкоцитов превышает определенный уровень (например, 1 млн/мл). Однако этим достаточно простым методом подсчитываются не только все лейкоциты (гранулоциты, лимфоциты, макрофаги), но и другие круглые клетки, например, круглые сперматиды, сперматоциты, сперматоспоры и слущенный эпителий. Как показал Keel [13], исследовавший 500 американских клинических лабораторий, в большинстве их них не знают о различиях этих методов. 35% из этих лабораторий не были ознакомлены с инструкциями ВОЗ или даже не имели ни одного экземпляра руководства, в котором говорится о важности использования и распространения стандартных методов анализа спермы.
Так как вместо определения количества лейкоцитов с помощью реакций до сих пор широко распространен подсчет, цель данного исследования — изучить корреляцию между лейкоцитоспермией и присутствием в сперме бактерий, а, следовательно, определить диагностическую ценность подсчета лейкоцитов для определения бактериоспермии. Все анализы проводили строго по инструкциям ВОЗ.
Материалы и методы
Были обследованы 143 мужчины, обратившиеся в клинику андрологии для анализа спермы. Причиной обращения в клинику было бесплодие. Всех пациентов обследовали клинически, включая осмотр и пальпацию пениса, мошонки и простаты, а также тщательно собирали анамнез. Все пациенты сдавали сперму для анализа и посева. До сдачи анализа не должно было происходить эякуляции по крайней мере в течение 3-5 дней. Пациенты должны были помочиться перед сдачей анализа, а также вымыть пенис, мошонку и руки водой с мылом. Им выдавали широко открывающуюся пластиковую банку и просили принести сперму в лабораторию не позднее, чем через полчаса после эякуляции. Если это было невозможно, эякуляция происходила в специальной комнате в клинике. Все образцы спермы получали в результате мастурбации.
Анализ спермы проводил один специально обученный лаборант не позднее, чем через час после эякуляции. Анализ проводился полностью по инструкции ВОЗ [14]. Учитывали концентрацию сперматозоидов, рН семенной жидкости, содержание лейкоцитов и возраст пациента. pH измеряли при помощи индикаторных бумажных полосок фирмы Merck (Merck KGaA, 64271 Дармштадт, Германия) (рабочий интервал pH 6.5-10.0). Однако в дальнейшем анализировали только содержание лейкоцитов и наличие роста бактерий в посевах.
Подсчитывали все клетки (макрофаги, гранулоциты), не определяемые как половые клетки и их предшественники. Не использованы никаких специальные методы окраски, таких как пероксидазная реакция и т.п. Для определения морфологии клеток использовали предметные стекла марки Testsimplets; Waldeck GmbH, Мюнстер, Германия, окрашенные метиленовым синим или ацетатом крезолового фиолетового. Лаборант помещал каплю спермы на предметное стекло, выдерживал ее при комнатной температуре в течение 2 часов и рассматривал под увеличением в 600 раз.
Концентрацию лейкоцитов подсчитывали по инструкции ВОЗ:
| N x S | |
| Количество лейкоцитов | = |
| 100 |
N — количество лейкоцитов в том же поле зрения, где находятся 100 сперматозоидов,
S — концентрация сперматозоидов (млн/мл). Подсчитывают не менее 200 лейкоцитов.
Наименьшее содержание лейкоцитов, определяемое этим методом — 3700 клеток/мл.
После анализа образцы спермы отправляли в отделение медицинской микробиологии для посева. Посев производили на экономически доступные агаровые среды. В дальнейшем анализировали только рост патогенных бактерий. Нормальную флору уретры не учитывали и включали в группу нормальной бактериальной флоры гениталий.
Статистический анализ производили при помощи статистического пакета программ для социальных наук (SPSS 10.0.7, SPSS.Inc. 1989-1999). Все демографические данные представлены медианой и 25-м и 75-м квартилями. Для определения диагностической ценности лейкоцитоспермии при выявлении роста бактерий вычисляли чувствительность, специфичность, положительное и отрицательное предсказательные значения (positive predictive value — PPV, negative predictive value — NPV), и отношение правдоподобия (likelihood ratio (LR)).
Таблица 1 — Результаты посевов спермы: произведен посев 143 образцов, взятых у мужчин с бесплодием. Определяли общее преобладание вида (в целом в двух группах), включая различные изоляты
| Виды бактерий | Группа I | Группа II | Преобладание |
| Ureaplasma urealyticum | 16 | 18 | 34/23.8 |
| Enterococcus faecalis | 15 | 9 | 24/16.8 |
| Escherichia coli | 4 | 6 | 10/7.0 |
| Бета-гемолитический стрептококк | 5 | 4 | 9/6.3 |
| Prevotella sp. | 3 | 6 | 9/6.3 |
| Bacteroides sp. | 4 | 2 | 6/4.2 |
| Коагулазо-негативный стафилококк | 3 | 2 | 5/3.5 |
| Staphylococcus aureus | 2 | 1 | 3/2.1 |
| Enterobacter sp. | 4 | 2 | 6/4.2 |
| Streptococcus viridans sp. | 0 | 2 | 2/1.4 |
| Анаэробные бактерии | 1 | 0 | 1/0.7 |
| Mycoplasma sp. | 1 | 0 | 1/0.7 |
| Gardnerella sp. | 1 | 0 | 1/0.7 |
Обозначение: группа I — нет лейкоцитов, группа II — присутствуют лейкоциты.
Таблица 2 — Количество изолятов патогенных бактерий
| Количество изолятов | Группа I (n = 39) | Группа II (n = 34) |
| 1 | 26 | 18 |
| 2 | 8 | 13 |
| 3 | 4 | 3 |
| 4 | 1 | 0 |
Обозначение: группа I — нет лейкоцитов, группа II — присутствуют лейкоциты.
Результаты
Из 143 образцов 81 не содержали лейкоцитов (группа I), а в 62 образцах лейкоциты были обнаружены (группа II). Медиана концентрации лейкоцитов в группе II составила 0,63 млн/мл (0,44-1,00 млн/мл). Проявлений инфекции (например, эпидидимита) не наблюдалось. Наиболее распространенными оказались следующие виды бактерий: Ureaplasma urealyticum (группа I: n = 16; группа II: n = 18), Enterococcus faecalis (группа I: n = 15; группа II: n = 9), Escherichia coli (группа I: n = 4; группа II: n = 6), бета-гемолитический стрептококк (группа I: n = 5; группа II: n = 4) и Prevotella sp. (группа I: n = 3; группа II: n = 6) (Таблица 1). Патогенные бактерии были обнаружены в 48,2% (39/81) образцов из группы I и в 54,8% (34/62) образцов из группы II. Нормальная бактериальная флора гениталий была обнаружена в 34 образцах из группы I и в 26 образцах из группы II, тогда как в 8 образцах группы I и в 2 образцах группы II роста флоры не было. Некоторые образцы содержали бактерии нескольких изолятов (Таблица 2).
Для определения диагностической ценности лейкоцитоспермии при выявлении бактерий, были выбраны пограничные значения концентрации лейкоцитов >0.25, >0.5, >0.75, и >1 млн/мл. Результаты представлены в Таблице 3. Чувствительность определения бактерий при концентрации лейкоцитов >0,25 млн/мл составила 0,47 при специфичности 0,60. Чувствительность и специфичность при концентрации лейкоцитов >1 млн/мл составили 0,16 и 0,84 соответственно. Наибольшее отношение правдоподобия (likelihood ratio — LR) — 1,29, было получено для концентрации лейкоцитов >0,5 млн/мл при чувствительности и специфичности 0,37 и 0,72 соответственно.
В группах с разной концентрацией лейкоцитов было подсчитано процентное соотношение образцов, содержащих бактерии. Бактерии были обнаружены в 27 (57,5%) образцах с концентрацией лейкоцитов >0,5 млн/мл, в 16 (51,6%) образцах с концентрацией лейкоцитов >0,75 млн/мл, в 12 (52,2%) образцах с концентрацией лейкоцитов >1 млн/мл и в 34 (54,8%) образцах в с концентрацией лейкоцитов >0,25 млн/мл.
Обсуждение результатов
В 51,1% (73/143) обследованных на предмет фертильности образцов спермы вне зависимости от наличия лейкоцитов были обнаружены бактерии.
Таблица 3 — Чувствительность, специфичность, положительное и отрицательное предсказательные значения (PPV и NPV) и отношение правдоподобия (LR) разного уровня лейкоцитоспермии для предсказания бактериоспермии
| Концентрация лейкоцитов (млн/мл) | Чувствительность | Специфичность | PPV | NPV | LR |
| >0.25 | 0.47 | 0.60 | 0.55 | 0.52 | 1.16 |
| >0.5 | 0.37 | 0.72 | 0.57 | 0.52 | 1.29 |
| >0.75 | 0.22 | 0.79 | 0.52 | 0.49 | 1.02 |
| >1 | 0.16 | 0.84 | 0.52 | 0.49 | 1.04 |
Нормальная флора кожи гениталий была обнаружена в 42,0% (60/143) образцов, и только 7,0% (10/143) образцов были стерильны. Наиболее часто обнаруживали U. urealyticum (23,8% (34/143) образцов). Этот вид бактерий обычно можно выделить у молодых людей при частых половых контактах и вызывает уретрит. Лейкоциты обнаружены в 43,4% (62/143) образцов, при этом в 16,1% (23/143) из них концентрация лейкоцитов превышала 1 млн/мл.