М.З.Федорова, В.Н. Левин
Критериями, характеризующими состояние белых клеток крови являются показатели их функциональной активности и сопротивляемости различным факторам. Причем, последнее свойство часто бывает более информативным показателем, т.к. угнетение функций может происходить при далеко зашедшей деструкции клеток, имеющей необратимый характер [ 1] . Особенно важное значение это положение имеет при анализе механизмов адаптации организма к экстремальным факторам среды.
Целью проведенного исследования было изучение реакций лейкоцитов на механические и осмотические воздействия в условиях дегидратации организма.
МЕТОДИКА
Опыты проведены на 48 беспородных белых крысах-самцах массой 370-420 г. Животных экспериментальных групп лишали воды при свободном доступе к сухому корму [ 4] . Оценку осмотической стойкости, осморегуляторных и деформационных реакций вели на 3, 6 и 10 сутки безводного содержания. Контролем служили интактные животные.
Для исследований использовали суспензию лейкоцитов в изотоническом забуференном растворе (раствор Дюльбекко), состоящую на 95-98% из лимфоцитов. Осмотическую стойкость, регуляторные возможности и мембранный резерв изучали, используя комплексный метод, подробно описанный ранее [ 6] . Суть метода сводится к следующему. Лейкоциты помещали в растворы хлорида натрия разной концентрации (0,9%; 0,45%; 0,2%). Время экспозиции в гипотонических растворах составляло 60 с и 1 ч. Данные по изменению морфометрических параметров клеток после инкубации в 0,45% растворе использовали для оценки регуляторных возможностей. Мембранный резерв определяли по изменениям площади поверхности лейкоцитов после 60-секундной инкубации в 0,2% растворе хлорида натрия. Расчеты объема и площади поверхности по стандартным формулам для шаровидных тел вели на основе измерения диаметра 50-60 клеток, фиксированных глутаровым альдегидом, помещенных на предметное стекло и окрашенных азур-эозином. Осмотичскую стойкость выражали числом (%) клеток сохранившихся после часовой экспозиции в 0,2% растворе хлорида натрия.
Для оценки деформационных свойств за основу была взята методика Tran-Son-Tay R. с соавт. [ 7] . Капилляры, диаметром 4 мкм заполняли изоосмотическим буфером и соединяли с манометром. Перемещение клеток к капилляру и в капилляре обеспечивалось постоянным во всех опытах отрицательным давлением (100 мм рт. ст.). Все манипуляции проводили в микрокапилляре на предметном столике микроскопа. Для наблюдений и замеров использовали объектив 40 ВИ и окуляр-микрометр МОВ-1-15* . После регистрации для каждой клетки первичных параметров (диаметр лейкоцитов в исходном состоянии, длина и ширина деформированной клетки, время восстановления до исходной формы) рассчитывали площадь поверхности и объем покоящихся и деформированных лейкоцитов. Для каждого животного было обсчитано 40-60 клеток.
Все полученные данные обработаны статистически. Достоверность различий опрделялась по критерию t Стьюдента.
Результаты исследования
Проведенное исследование показало, что к 3-м суткам дегидратации происходило существенное уменьшение размеров лейкоцитов крови. В дальнейшем (6-10 сутки) за счет включения регуляторных механизмов клеточный объем восстанавливался до уровня интактных животных (табл. 1).
Умеренная гипоосмотическая нагрузка (60 с в 0,45% растворе хлорида натрия) приводила к достоверному увеличению объема лимфоцитов у контрольных животных, а также на 6 и 10-е сутки безводного содержания (18¸ 32%, р< 0,01). На 3 сутки дегидратации объемные изменения были незначительны (12%, р > 0,05). Высокий осмотический градиент (60 с в 0,2% растворе хлорида натрия) вызывал достоверное увеличение размеров клеток у всех животных (табл. 1). Однако, в контрольной группе изменения объема лимфоцитов были значительно больше, чем в экспериментальных (54% против 19¸ 32%, р< 0,01). Увеличение площади поверхности в этих условиях составляло: контрольная группа - 33%, 3 сутки дегидратации - 12%, 6 и 10 сутки - 20%. Т.е. мембранный резерв эффективнее использовался лейкоцитами интактных животных.
Таблица 1
Размеры лимфоцитов, инкубированных в растворах хлорида натрия разной осмолярности
| Концентрация раствора, время инкубации | ||||
| Группа | 0,9% | 0,45%, 60 с | 0,45%, 1 ч | 0,2%, 60 с |
| Контроль | 5,2± 0,05(74) | 5,7± 0,07° (97) | 5,3± 0,07(78) | 6,0± 0,1° (113) |
| 3 сутки дегидратации | 5,0± 0,06* (65) | 5,2± 0,1* (74) | 4,9± 0,05* (62) | 5,3± 0,07* ° (78) |
| 6 сутки дегидратации | 5,3± 0,07(78) | 5,6± 0,07° (92) | 5,3± 0,06(78) | 5,8± 0,06° (102) |
| 10 суткидегидратации | 5,2± 0,06(74) | 5,5± 0,06* ° (87) | 5,2± 0,08(74) | 5,7± 0,07* ° (97) |
Примечание. В таблице представлены значения диаметра клеток (мкм). В скобках - объем лейкоцитов (мкм3). Звездочкой обозначена достоверность различий по сравнению с параметрами клеток контрольных животных (р< 0.05), кружочком - достоверность внутригрупповых различий с клетками, инкубированными в изотоническом растворе (р< 0.05).
Кинетика объема клеток при увеличении времени инкубации в 0,45% растворе хлорида натрия до 1 ч была примерно одинаковой у животных всех групп (табл. 1). Диаметр лимфоцитов уменьшался на 8,4% (р< 0,01) у интактных животных и 6,0¸ 6,5% (р< 0,01) у животных экспериментальных групп. Реакции регуляторного уменьшения объема приводили к восстановлению исходных параметров клеток.
Динамика осмотической стойкости лимфоцитов на разных стадиях обезвоживания организма отличалась от фазных изменений объема. С увеличением сроков водной депривации осмотическая стойкость лейкоцитов возрастала, достигая достоверных различий по сравнению с контролем к 10 суткам (контроль - 70± 7%; 3 сутки дегидратации- 69± 5,5%; 6 сутки - 76± 5,9%; 10 сутки - 95± 2,2%).
Изучение деформационных реакций лейкоцитов проводилось на живых клетках, помещеных в изотоничную среду. Несмотря на то, что глутаровый альдегид считается фиксатором, сохраняющим прижизненное состояние клетки [ 3] , морфометрические показатели, замеренные для оценки осморегуляторных реакций оказались ниже, чем полученные в данных опытах. Значение диаметра лимфоцитов до деформации были 7,0-7,5 мкм. Различия результатов измерений возможно вызваны влиянием иммерсионной среды (солевой раствор) и материалом микрокамеры при изучении деформабельности, либо глутарового альдегида при оценке объемных изменений в гипотонических растворах. Несмотря на имеющиеся различия абсолютных значений первичных параметров, динамика их изменений позволяет оценить сопротивляемость лейкоцитов механическим воздействиям и сопоставить с данными по осморегуляции.
Таблица 2
Деформационные изменения и время восстановления исходной формы лейкоцитов на разных стадиях обезвоживания организма
| Группа | Р1мкм2 | Р2мкм2 | V1мкм3 | V2мкм3 | Тс |
| Контроль | 172± 5,6 | 232± 10,9° | 224± 11,7 | 222± 11,5 | 70± 3,9 |
| 3 сутки дегидратации | 165± 5,3 | 220± 10,3° | 211± 10,8 | 210± 10,7 | 71± 4,5 |
| 6 суткидегидратации | 162± 4,2 | 217± 8,3° | 202± 8,4 | 200± 8,3 | 92± 4,1* |
| 10 суткидегидратации | 165± 4,3 | 217± 8,6° | 207± 9,2 | 204± 8,9 | 94± 3,7* |
Примечание. Р1 - исходная площадь поверхности клеток; Р2 - площадь поверхности деформированных клеток; V1 -исходный объем клеток; V2 - объем деформированных клеток; Т - время восстановления исходной формы лейкоцитов. Звездочкой обозначена достоверность различий по сравнению с контрольной группой (р< 0,01); кружочком - внутригрупповые различия по сравнению с исходными показателями (р< 0,01).
Деформация клеток при прохождении через микрокапилляр за счет приложения внешних сил осуществлялась при постоянном объеме и увеличении площади поверхности (табл. 2). Используемый при этом "мембранный резерв" был фактически одинаковым у животных всех групп и составлял 32-35%. Отмеченного выше уменьшения объема циркулирующих клеток на 3 сутки дегидратации этой методикой не выявлено. Важным показателем, позволяющим судить о функциональном состоянии клеток является время восстановления исходной формы после деформации. Динамика этой характеристики отражена в табл. 2. Сравнительная оценка использования "мембранного резерва" при деформации лейкоцитов и при набухании в средах с низкой осмолярностью показала, что в контрольной группе он используется примерно в том же "количестве" (35% и 33%). У животных экспериментальных групп превращение клеток из сферических в цилиндрические идет за счет такого же "резерва" мембраны, что и у интактных животных, а объемные изменения в гипотонических растворах выражены значительно слабее.
Обсуждение результатов
Анализ полученных данных позволил установить, что при воздействии на лейкоциты интактных животных осмотических и механических факторов включаются ауторегуляторные механизмы. Они обусловливают эффективное использование пластичных свойств цитоплазматической мембраны, других клеточных структур и быстрое восстановление геометрической формы. Последнее имеет важное функциональное значение, т.к. клеточный объем выполняет роль вторичного посредника в регуляции относительной эффективности анаболизма и катаболизма [ 5] . Водная депривация уже на первом этапе (3 сутки) ведет к ослаблению реактивности изученной клеточной системы, о чем свидетельствуют меньшие изменения объема в гипотонических средах. Длительное безводное содержание животных сопровождается дезинтеграцией механизмов клеточной ауторегуляции. При одинаковых с интактными животными исходных параметрах клетки и динамике объемных изменений, выраженность последних значительно ниже. Параллельно возрастает осмотическая стойкость и время восстановления до исходной формы после деформации. Объяснением этих фактов могут служить данные об индукции в клетке синтеза белков, увеличивающих устойчивость к различным факторам. При этом повышается вязкость цитоплазмы вплоть до ее желатинизации. В основе гелеобразования лежит полимеризация актина и образование трехмерной сети [ 1,2] . Желатинизация цитоплазмы является паранекротическим сдвигом, но на обратимых стадиях повреждения физиологические функции остаются на высоком уровне [ 1] .