содержание
1. ВВЕДЕНИЕ. 3
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 6
3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материал исследования. 29
3.2. Методы исследования. 29
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Количественное содержание гемоглобина и основных белков мембран эритроцитов человека. 34
4.2. Взаимное варьирование количественной представительности отдельных белков эритроцитов человека. 36
4.3. Обсуждение. 39
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 40
6. ВЫВОДЫ.. 41
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.. 42
Мембрана эритроцита в течение долгого времени представлялась исследователям лишь оболочкой, отделяющей гемоглобин от плазмы. Роль мембраны в функционировании этой высоко специализированной клетки, казалось, ограничивается только способностью быть проницаемой для газов крови. Однако успехи, достигнутые в мембранологии за последние годы и, в частности, изучении мембраны эритроцита млекопитающих с помощью биохимических и биофизических методов, заставляют в настоящее время по-иному взглянуть на роль мембраны в работе клетки. Совокупность имеющихся в литературе данных позволяет сделать вывод о том, что плазматическая мембрана эритроцита – важнейший элемент клетки; она одновременно является и механической оболочкой с регулируемыми физическими свойствами, и "диспетчерской" клетки, осуществляющей координацию работы клетки в зависимости от физических и химических сигналов, поступающих к ней в организме. [9]
Важнейшие компоненты биологических мембран – белки, которые осуществляют их специфические функции. Одни из них обеспечивают транспорт определенных молекул внутрь клетки или из нее, другие являются ферментами и катализируют ассоциированные с мембраной реакции, третьи осуществляют структурную связь цитоскелета с внеклеточным матриксом или служат в качестве рецепторов для получения и преобразования химических сигналов из окружающей среды. Мембранные белки, образующие цитоскелет, соединяются друг с другом специфическим для каждого типа клеток образом и формируют сложные динамически взаимодействующие между собой структуры. Эти структуры и отвечают непосредственно за согласованное поведение частей клеток. [4] Гемоглобин можно считать своего рода модельным белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Десятки лет исследований гемоглобина во многих лабораториях мира привели к значительному прогрессу в описании и понимании физических, химических и биологических аспектов его функционирования. [2] Однако, несмотря на это, в научной литературе недостаточно подробно освещен вопрос о связи гемоглобина со структурными белками эритроцитарных мембран.
Изучение структуры мембраны эритроцита человека и прежде всего входящих в их состав белков является актуальным, поскольку ряд наследственных патологий (сфероцитарные анемии, миодистрофии, некоторые заболевания центральной нервной системы) характеризуются различными нарушениями в белковой компоненте эритроцитарной мембраны и как следствие нарушением ее структурно-функциональной организации. [7] Определенные факторы среды могут изменять экспрессию генов, что отражается на жизнедеятельности как отдельных органов и систем, так и организма в целом. Некоторые авторы рассматривают уровень гемоглобина в крови как универсальный неспецифический показатель адаптационных процессов, процессов напряженности организма в ответ на различные внешние воздействия. [1] Так, следствием действия таких факторов может явиться уменьшения количества гемоглобина в крови или нарушения структурно-функциональной организации белковой компоненты мембран эритроцитов. Результатом таких изменений служит ряд патологий, и, как следствие, - значительное снижение адаптационных возможностей человека. Поэтому на сегодняшний день актуально изучение структуры мембрансвязанного гемоглобина, оценка его количественного содержания и взаимосвязь со структурными белками эритроцитарных мембран. В связи с начавшимся систематическим изучением продуктов экспрессии генов человека в рамках молекулярно-анатомического направления представляется крайне важным установление количества и основных свойств полипептидов, входящих в состав мембраны эритроцита, и составление каталога белков. Возможности этих исследований, а также поиска первичного биохимического дефекта при наследственных аномалиях существенно возросли после широкого распространения метода двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). [7]
Целью настоящего исследования явилось изучение количественного содержания мембраносвязанного гемоглобина эритроцитов человека и его связи со структурными белками.
В силу своей специализации (перенос кислорода от легких к тканям) эритроцит по механическим свойствам является уникальной клеткой, так как в отличие от других клеток постоянно подвергается выраженным деформирующим воздействиям в кровеносном русле. [9]
Для нормального функционирования эритроцит должен в течение относительно длительного периода времени сохранять свою целостность и быть хорошо деформируемым; последнее свойство важно прежде всего для нормальной микроциркуляции. В свою очередь деформируемость определяется рядом факторов, основные из которых – форма клетки и эластичность мембраны. Сейчас можно считать доказанным, что эти свойства мембраны эритроцита и клетки в целом обусловлены наличием белковой мембранной структуры, именуемой мембранным скелетом клетки и расположенной на внутренней стороне мембраны. [9] Плазматическую мембрану эритроцитов следует рассматривать как открытую динамическую структуру, способную специфически и неспецифически связывать белки плазмы крови и цитозоля эритроцитов. [6] Исследователи пытаются выяснить механизмы метаболического регулирования белковых взаимодействий компонентов мембранного скелета между собой, а также с интегральными белками мембраны, что должно подвести к пониманию природы таких процессов, как изменение формы и деформируемости, работа транспортных систем, изменение ионной проницаемости мембраны. В данном обзоре сделана попытка обобщить и осмыслить имеющиеся данные по этому вопросу.
Современные представления о структуре и функции мембранного скелета эритроцитов человека и других млекопитающих сложились в основном за последние 25 – 30 лет. За этот период опубликован ряд подробных обзоров. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю поверхность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. Мембранный скелет виден в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготовления препарата для микроскопии. Белковые компоненты мембранного скелета были идентифицированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС).
Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембраны эритроцитов человека является работа Фейрбанкса и соавторов, в которой авторы предложили номенклатуру полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированных с помощью ДДС мембране; этой номенклатурой пользуются в настоящее время большинство исследователей. При одновременном электрофорезе солюбилизированных белков эритроцитарной мембраны в ПААГ в присутствии ДДС выявляется 20 полос, однако Фейрбанкс с соавторами выделили 7 основных полос, которые были пронумерованы от катода к аноду. В последующие годы были внесены лишь незначительные уточнения в эту номенклатуру. [9]
В связи со способом расположения макромолекул в мембране эритроцита белки делят на периферические (внутренние) и интегральные. Интегральные удерживаются в мембране. В их состав входят гликопротеины и протеолипиды. Функции интегральных белков разнообразны: они могут выступать в роли гидролитических ферментов, рецепторов клеточной поверхности, окислительно-восстановительных компонентов транспортной системы электронов и в качестве специфических белков входит в состав цитоскелета, который представляет собой двумерную сеть, соединенную непосредственно с мембраной эритроцита через взаимодействие с интегральными белками. Также к периферическим белкам относится ряд эритроцитарных ферментов.
Метод фракционирования мембранных белков одномерным электрофорезом в ПААГ в присутствии ДДС позволили разделить белки мембраны относительно их электрофоретической подвижности, и полученным фракциям белков были даны номера по мере уменьшения их молекулярной массы.
Полосы 1 и 2 Включают отдельные a- и b-субъединицы спектрина.
Спектрин – основной белок цитоскелета эритроцитов. Спектрин образует двумерную сеть, к которой крепятся актиновые олигомеры. Молекула спектрина представляет собой ab-гетеродимер. По данным электронной микроскопии, гетеродимеры имеют форму изогнутых фибрилл длиной около 100 нм. Они могут принимать разные конфигурации. Каждая цепь молекулы спектрина содержит более 2000 аминокислотных остатков и состоит из линейно расположенных структурных доменов. Доменная структура была установлена с помощью анализа пептидных фрагментов субъединиц. Вторичная структура a- и b-субъединиц сходна и представляет собой a-спиральные участки, разделенные чувствительными к протеолизу b-структурами. Димеры спектрина ассоциируются с b-цепью другого димера "голова к голове". Никогда не встречаются a-a- или b-b-связи. Между димерами и тетрамерами существуют обратимые переходы, которые зависят от условий среды. При 37 °С спектрин экстрагируется из мембран эритроцитов в форме димера, при 4 °С – в форме тетрамера. При 30 и 40 °С в растворе между димерами и тетрамерами устанавливается равновесие. Так как в обычных условиях получения спектрин экстрагируется в форме тетрамера, полагали, что invivo спектрин находится в той же форме. Электронно-микроскопический анализ свидетельствует о том, что такие олигомеры образуются в результате ассоциации 3-7 димеров спектрина. Полагают, что в эритроцитах присутствуют как олигомеры, так и тетрамеры, которые образуют двумерную сеть цитоскелета. Молекула спектрина подвергается множественному фосфорилированию, степень которого не влияет на форму эритроцитов. [5]