Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК; знание последовательности, а следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная конформация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную форму.
Определение структуры тРНК позволило выявить ряд отличительных участков; так, на 3'-гидроксильном конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН- группу концевого аденилового нуклеотида, хотя получены доказательства возможности присоединения аминокислоты через 2'-ОН- группу. Тимин-псевдоуридин-цитидиловая (Т(Ц) петля, по-видимому, связывает аминоацил-тРНК с поверхностью рибосомы. Имеется, кроме того, добавочная петля, состав которой варьируется у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Дигидроуридиловая петля, с другой стороны, оказалась необходимой как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом — аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется также антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, куда присоединяется аминокислота. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они являются антипараллельными в своей комплементарности.
Тщательный анализ нуклеотидных последовательностей разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид — ГМФ со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей аминокислотой. Но поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислоты не существует соответствия и сродства, эту функцию узнавания должна выполнять белковая молекула, которая узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты.
Природа генетического кода
Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК, переводится еще в ядре в нуклеотидную последовательность мРНК. Однако вопрос о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу, долго не был выяснен. Первые указания на существования прямой функциональной зависимости между структурой гена и его продуктом — белком можно найти у Ч. Яновского, который в серии изящных опытов с применением методов генетического картирования и сективирования показал, что порядок изменений в структуре мутантного гена триптофанситазы у E. coli в точности соответствует порядку соответствующих изменений в аминокислотной последовательности молекулы белка-фермента.
Ранее было известно, что молекулы мРНК не обладают сродством к аминокислотам, поэтому для перевода нуклеотидной последовательности мРНК на аминокислотную последовательность белков требуется некий посредник, названный адаптором. Молекула адаптора должна быть в свою очередь наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Обладая подобной адапторной молекулой клетка может включать каждую аминокислоту в подходящее место полипептидной цепи, в строгом соответствии с нуклеотидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, незыблемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот не обладают способностью вступать в контакт с матрицей информационной мРНК.
Было показано, что в нуклеотидной последовательности молекулы мРНК имеются кодовые слова для каждой аминокислоты — генетический код. Проблема , однако, сводится к тому, из чего состоит этот таинственный код? Вероятнее всего, он заключается в определенной последовательности расположения нуклеотидов в молекуле ДНК . Вопросы о том, какие нуклеотиды ответственны за включение определенной аминокислоты в белковую молекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, оставался нерешенным до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только 4 аминокислоты могут кодироваться. Но код не может быть и дуплетным, т.е. комбинация из двух нуклеотидов из четырехбуквенного алфавита не может охватывать всех аминокислот, так как подобных комбинаций теоретически возможно только 16 (4^2=16), а в состав белка входят 20 аминокислот. Для всех аминокислот белковой молекулы было бы достаточно взять триплетный код, когда число возможных комбинаций составит 64 (4^3=64).
Из приведенных выше данных М. Ниренберга становится очевидным, что поли-У, т.е. РНК, гипотетическисодержащая остатки только одного уридилового нуклеотида, способствует синтезу белка, построенного из остатков одной аминокислоты — фенилаланина. На этом основании был сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую молекулу может служить триплет, состоящий из 3 уридиловых нуклеотидов — УУУ. Вскоре было показано, что синтетическая матричная полицитидиловая кислота (поли - Ц) кодирует образование полипролина, а матричная полиадениловая кислота (поли-А) — полилизина. Соответствующие триплеты — ЦЦЦ и ААА — действительно оказались триплетами (названными кодонами) для кодирования пролина лизина.
М.Ниренберг, С. Очоа и Х. Корана, пользуясь искусственно синтезированными мРНК, представили доакзательства не только состава, но и последовательности триплетов всех кодонов, ответственных за включение каждой из 20 аминокислот белковой молекулы.
Генетический коод для аминокислот является вырожденным. Это означает, что подавляющее число аминокислот кодируетяс несколькими кодонами, за исключением метионина и триптофана, по существувсе остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона. Вырожденность кода оказывается неодинаковой для разных аминокислот. Так, если для серина, аргинина и лейцина имеется по 6 кодовых слов, то ряд других аминокислот, в частности глутаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по два кодона, а триптофан — только 1. Следует отметить, что вырожденность чаще всего касается только третьего нуклеотида, в то время как для многих аминокислот первые два нуклеотида являются общими. Вполне допустимо поэтому предположение, что последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, в то время как третий нуклеотид менее существен. В последнее время появились доказательства гипотезы два из трех, означающей, что код белкового синтеза , возможно, является кввази- или псевдодуплетным. Имеются доказательства, что вырожденность генетического кода имеет несомненный биологический смысл, обеспечивая организму ряд преимуществ. В частности, она способствует "совершенствованию" генома, так как в процессе мутации могут наступать различные аминокислотные замены, наиболее ценные из которых отбираются в процессе эволюции.
Другой отличительной особенностью генетического кода является его непрерывность, отсутствие знаков препинания, то есть сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, одноанправленным и непрерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ. Это свойство генетического кода обеспечивает синтез в высшей степени упорядоченной последовательности молекулы белков. Во всех других случаях последовательность нуклеотидов в кодонах будет нарушаться и приводить к синтезу "бессмысленной" полипептидной цепи с измененной структурой. Следует указать на еще одну особенность кода — его универсальность для всех живых организмов: от Е. соli до человека.
Среди 64 мыслимых кодонов смысл имеет 61, то есть кодирует определенную аминокислоту. В то же время три кодона, а именно УАГ, УАА, УГА являются бессмысленными, нонсенс-кодонами, так как они не кодируют ни одной из 20 аминокислот. Однако эти кодоны не лишены смысла, поскольку выполняют важную функцию в синетзе белка в рибосомах (функцию окончания, терминации синтеза).
При исследовании генетического кода в опытах in vivo были также получены доказательства универсальности кода. Однако в последнее время выяснены некоторые отличия кода в митохондриях эукариот животных, включая человека, отличающегося четырьмя кодонами от генетического кода цитоплазмы, даже тех же клеток. В частности, АУГ, являющийся обычно инициаторным кодоном, кодирует также метионин в цепи, и УГА, являющийся нонсенс-кодоном, кодирует в митохондриях триптофан. Кроме того, кодоны АГА и АГГ являются для митохондрий скорее терминирующими, а не кодирующие аргинин. Как результат этих изменений, для считывания генетического кода митохондрий требуется меньше разных тРНК, в то время как цитоплазматическая система трансляции обладает полным набором тРНК.
Этапы синтеза белка
Синтез белка предсавляет собой циклиыеский многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерменированную последовательность с образованием полипептидов. Система белкового синтеза, точнее, система трансляции, которая использует генетическую информацию, транскибированную в мРНК, для синтеза полипептидной цепи с опрределенной первичной структурой, включает около 200 типов макромолекул — белков и нуклеиновых кислот. Среди них около 100 макромолекул, участвующих в активировании аминокислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул, входящих в состав 70S или 80S рибосом, и около 10 макромолекул (называемых белковыми факторами), принимающих непосредственное участие в системе трансляции. Не разбирая подробно природу других важных для синтеза факторов, рассмотрим подробно механизм индивидуальных путей синтеза белковой молекулы в искусственной синтезирующей системе. Прежде всего, при помощи изотопного метода было выяснено, что синтез белка начинается с N-конца и завершается С-концом, т.е. процесс протекает в направлении NH2 ( COOH.