Значительное увеличение содержания характерных для опухолевых клеток фракций ферритинов с повышенным количеством Н-субъединиц может быть следствием нескольких причин:
интенсивного некроза опухолевой ткани из-за недостаточности трофики быстро растущей опухоли;
эффективной противораковой терапии, приводящей к прямому высвобождению цитозольного ферритина;
активного синтеза и секреции специфических опухолевых форм ферритинов;
патологического перераспределения железа с его накоплением в клетках ретикулоэндотелиальной системы;
изменений функционирования печени, приводящих к нарушению циркуляции ферритина.
Взаимосвязь плазматического ферритина со многими физиологическим процессами в организме позволяет отнести его к белкам острой фазы и к опухолевым маркерам.
7. Содержание ферритина в сыворотке крови
Таблица 2. Содержание ферритина в сыворотке крови в норме.
| Возраст | Содержание ферритина, нг/мл (мкг/л) |
| Новорожденные | 25-200 |
| 1 месяц | 200-600 |
| 6 месяцев - 15 лет | 30-140 |
| Взрослые: мужчины | 20-350 |
| Женщины | 10-150 |
| Беременность: Первый триместр | 56 |
| Второй триместр | 27 |
| Третий триместр | 10 |
| DPC "Immulite" | 1.22 |
В первый месяц после рождения концентрация ферритина повышена в связи переходом от фетальной формы гемоглобина к взрослой.
Содержание ферритина в плазме у женщин репродуктивного возраста значительно меньше, чем у мужчин. Это связано с ежемесячными физиологическими кровопотерями, а также с деторождением. За весь период беременности дополнительно расходуется около 1 г железа, что явно прослеживается в прогрессивном снижении ферритина в крови. В третьем триместре беременности концентрация ферритина минимальна и граничит со значениями, характерными для ЖДА. Лактация также сопровождается повышенным расходом железа, так как молочная железа продуцирует белок с подобными трансферрину свойствами - лактоферрин.
В постменопаузальный период содержание железа и концентрация ферритина в организме женщин возрастают, приближаясь к показателям у мужчин [46].
В случае перегрузки организма железом концентрация ферритина превышает 400-500 нг/мл, а при ярко выраженном гемохроматозе может достигать 10 000 нг/мл и более.
Несмотря на низкое содержание железа в плазматическом ферритине, концентрация ферритина в плазме коррелирует как с резервными запасами железа в организме, так и его общим количеством. Определяя в сыворотке крови содержание ферритина, на самом деле мы определяем концентрацию белковой части комплекса, апоферритина. Концентрация апоферритина в крови соответствует общему уровню ферритина в тканях и, следовательно, содержанию запасов железа.
При повторных заборах крови (такая процедура является способом терапии перегрузки организма железом) запасы железа уменьшаются. Это подтверждается косвенными лабораторными тестами (снижением уровня гемоглобина, насыщения трансферрина). При этом концентрация ферритина в плазме также снижается.
При повторных переливаниях крови, что является способом терапии при сидероахрестических и гемолитических анемиях - неиспользовании железа для синтеза гема или повышенном разрушении эритроцитов, запасы железа в организме быстро увеличиваются в связи с ограниченными способностями организма к выделению избытка железа (так называемый ятрогенный трансфузионный сидероз). Пропорционально количеству запасаемого железа возрастает и концентрация ферритина в плазме.
Рис. 5 Г. Диапазон значений концентраций ферритина в норме (область, выделенная серым) и при различных патологиях [47]. Горизонтальный штрих - среднее значение в группе.
Для здоровых лиц был предложен фактор эквивалентности (коэффициент пересчета): 1 нг ферритина в 1 мл сыворотки соответствует 8 мг (143 мкмоль) железа, хранимого в депо.
Таким образом, диагностическая ценность измерения сывороточного ферритина неоспорима.
8. Иммунологические свойства ферритина
В настоящее время для измерения концентрации ферритина в сыворотке крови используются иммунологические методы анализа. Для правильного определения исследуемого антигена необходимо использовать высокоспецифичные к анализируемому веществу антитела. Правильный выбор антител можно сделать, зная особенности антигенного строения ферритина.
Ферритин представляет собой сложный белок с выраженной четвертичной структурой (см. п. 3.). Вследствие этого большинство антигенных детерминант на его поверхности являются конформационно зависимыми. В литературе описаны специфичность и аффинность широкого круга как поликлональных, так и моноклональных антител к ферритину. Показано, что антитела обладают специфичностью не только в межвидовом, но и в межтканевом отношении. Так, в зависимости от относительного содержания в молекуле Н- и L-субъединиц антитела проявляют различное сродство к ферритину. Например, в работе [49] при использовании в качестве иммуногена ферритина из печени человека перекрестная реактивность полученных моноклональных антител с селезеночным ферритином составляла 74%, а с сердечным ферритином - всего 13%.
Белковая оболочка, лишенная кластера железа, проявляет большую иммунологическую активность по сравнению с ферритином, нагруженным железом. Вероятно, это вызвано повышением конформационной лабильности молекулы, что способствует вовлечению во взаимодействие с антителами участков, не доступных или малодоступных в нативной молекуле. Адсорбция апоферритина на полистироле приводила к практически полной утрате иммунологической реактивности, что также указывает на конформационный характер эпитопов молекулы [50].
Антитела к одиночным субъединицам ферритина выявили существенные отличия в их антигенном строении. Антигенные детерминанты Н- и L-субъединиц ферритина отличаются друг от друга, а также от антигенных детерминант нативного ферритина. Часть антигенных детерминант локализована во внутренней полости молекулы и в районах межсубъединичных контактов, и маскируется взаимодействием субъединиц при образовании молекул апоферритина и ферритина.
Данные работ [51, 52] свидетельствуют о том, отдельная субъединица ферритина обладает несколькими эпитопами для связывания с антителами. Однако сопоставление пространственных размеров одного эпитопа (в типичном случае около 2х3 нм) и субъединицы ферритина (5,5х2,7 нм) приводит к заключению, что одна субъединица ферритина способна связать только одну молекулу антитела. Эксперименты [53] по исследованию конкуренции антител показали, что основные (иммунодоминантные) эпитопы ферритина для моно- или поликлональных антител перекрываются и, скорее всего, образуют кластеры, группируясь в пределах ограниченного участка антигенной поверхности субъединицы или зоны контакта субъединиц. Под влиянием стерических факторов одновременное связывание двух различных молекул антител в пределах одного кластера либо исключено, либо, по крайней мере, затруднительно.
Из общего числа кластеров эпитопов, максимальное количество которых ограничено числом субъединиц ферритина (24) только 3-4 доступны для одновременного связывания антител. Данный вывод о максимальной валентности ферритина сделан в работе [54] на основании геометрических расчетов по известному внешнему диаметру сферической глобулы ферритина (12-13 нм) и минимальному расстоянию между центрами двух молекул антител, способными расположиться на антигенной поверхности без стерических затруднений (12-14 нм).
Определение концентрации ферритина в сыворотке крови первоначально осуществлялось радиоиммунологическими методами, основанными на конкуренции за связывание с антителами антигена из сыворотки крови и его радиоактивно меченого аналога [55]. Несколько позднее стал применяться неконкурентный иммунорадиометрический метод, использующий возможность одновременного связывания с молекулой ферритина двух молекул антител [56].
Особенностью ферритина является наличие нескольких сайтов связывания антител, некоторые из них повторяются. Как было сказано выше, в целом глобула обладает размерами, достаточными для одновременного связывания с четырьмя молекулами антител. Поэтому для выявления ферритина в основном используют неконкурентный метод анализа. Данный выбор связан не только со сложностью конъюгирования ферритина с меткой и возможностью нарушения при этом его антигенной структуры, но и с необходимостью обеспечения высокой чувствительности анализа для выявления ЖДА, недостижимой при конкурентной схеме.
Применение моноклональных антител с различной эпитопной направленностью для связывания и детекции антигена делает возможным проведение иммунологической реакции в одну стадию, при этом отсутствует конкуренция между "верхними" и "нижними" антителами за связывание с общими эпитопами, искажающая результаты анализа. Проведение анализа в одну стадию позволяет снизить расход реагентов и стоимость анализа, уменьшить занятость лабораторного оборудования и значительно сэкономить рабочее время.
9. Основные характеристики иммуноферментных тест-систем для количественного определения ферритина
В настоящее время практически все предлагаемые тест-системы основаны на неконкурентном методе определения ферритина. Однако используемые разными производителями антитела, поверхность твердой фазы, способы детекции сигнала и другие параметры разнятся очень значительно (см. п. 9).
Результаты сравнения аналитических характеристик тест-систем производства различных фирм приведены в табл. 3.
Таблица 3. Аналитические характеристики наборов для определения ферритина различных производителей.
| Производитель | Особенности методики | Используемые антитела | Первая и последняя КП, нг/мл; аттестация | Чувст витель ность, нг/мл | Эффект высоких концент раций, нг/мл |
| DPC "Immulite" | Одностадийный "сэндвич", инкубация 30мин, объем сыворотки 10 мкл, регистрация хемилюминесценции. | Иммобилизованные - мышиные моноклональные, конъюгат - козьи поликлональные со щелочной фосфатазой. | 10; 1500IS 80/578 | 1.5 | 73 000 |
| Roche "Cobas Core" | Одностадийный "сэндвич". В качестве "твердой фазы" используются полистирольные шары. Инкубация 15мин/37°С, объем сыворотки 20 мкл. Субстрат - ТМБ. | Мышиные моноклональные к 2-м эпитопам для иммобилизации и конъюгирования с ПХ. | 75; 1200IS 80/602 | 2 | 300 000 |
| Delfia | Двухстадийный "сэндвич", обе инкубации по 1 часу при комнатной Т, объем сыворотки 20 мкл. Регистрация флуоресценции (Eu метка). | Мышиные моноклональные. | 2; 1000IS 80/578 | 0.5 | 120 000 |
| IBL | Одностадийный "сэндвич", инкубация 45 мин при комнатной Т, объем сыворотки 20 мкл. | Иммобилизованные - кроличьи, для конъюгирования с ПХ - моноклональные мышиные. | 15; 1000IS 80/602 | 5 | 12 000 |
| Randox | Турбидиметрический метод измерения | Антисыворотка на латексных частицах. | 5; 450 | 5 | 2 000 |
| DSL | Двухстадийный "сэндвич", инкубации 30 и 60 мин при комнатной температуре, объем сыворотки 50 мкл. | Поликлональные козьи против селезеночного ферритина человека, метка - I125 | 8; 1000IS 80/602 | 3.6 | 10 000 |
| Beckman Coulter | Одностадийный "сэндвич", инкубация 20 мин при 36,5°С, объем сыворотки 10 мкл. | Парамагнитные частицы, покрытые козьими АТ против иммуноглобулинов мыши, связывающие мышиные моноклональные АТ к ферритину; конъюгат - козьи АТ со щелочной фосфатазой | 10; 1500 | 0.2 | |
| Roche "Elecsys" | Одностадийный "сэндвич". Общее время проведения анализа - 18 мин. Объем сыворотки 15 мкл. Регистрация электрохемилюминесценции. | Мышиные моноклональные к 2-м эпитопам для иммобилизации и конъюгирования с ПХ | 0,5; 2000 | 0.5 | 200000 |
| Алкор Био | Одностадийный "сэндвич", инкубация 30мин/37°С или 45 мин при комнатной Т, объем сыворотки 20 мкл. | Мышиные моноклональные к 2-м эпитопам для иммобилизации и конъюгирования с ПХ | 10; 1000IS 80/578 | 5 | 10 000 |
В табл.4 приведена ориентировочная стоимость реагентов, необходимых для выполнения одного анализа наборами реагентов разных производителей. Стоимость рассчитана по ценам производителя или его официального дистрибьютора в России (при условии проведения анализа в соответствии с инструкцией производителя).