Аденилатциклазный сигнальный механизм (стр. 2 из 8)

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных.

2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Þ Gi-белок (βγ-димер) Þ ФИ-3-К Þ ПКСzÞ Gs-белок Þ АЦ.

3. С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз.

4. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.

5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности.

Апробация работы

Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн, Германия, 2002); 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона, 1997); XXXIII Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997); 2-й съезд Биохимического Общества РАН (Москва, 1997); XVII съезд физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 1998); Съезд Биохимического общества Университета Глазго (Глазго, Великобритания, 1999); 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000); 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004); XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Международная Европейская конференция (Люксембург, 2002); Вторая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвященная 80-летию со дня рождения М.Г. Колпакова. (Новосибирск. Октябрь, 2002); 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005);

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях.

Личный вкладавтора – Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем диссертации.Диссертация изложена на 259страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43рисунками и 35 таблицами.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar; 2) куры породы русская белая «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea; 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и E1A+E1B (клетки, не впадающие в апоптоз).

Методы. В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов:

- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);

- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);

- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).

- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - [α³²P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некоторыми модификациями);

- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [³H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);

- электрофорез в ПААГ

- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКСζ;

- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [¹⁴C] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);

- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavinet.al., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003);

- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras (Плеснёва и др., 2003);

- определение активности ферментов углеводного метаболизма – гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);

- определения содержания белков методом Лоури;

- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина.

- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova).

Результаты исследования и их обсуждение

В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.

Основные этапы работы состояли в исследовании:

- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации invitro и invivo;

- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов;

- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем);

- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии;

Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки

Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10^-8М и для сравнения эпидермального ростового фактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987). Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236%. Эффект менее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска +124% (Рис. 1; Таблица 1).

Рис. 1. Концентрация пептидов – 10^-8М Активация АЦ пептидами (в%) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)

Таблица 1.Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	71.2±4.8(100%)	85.11±3.3(100%)	101.20±9.24(100%)
+ ИФР-1	214.31±12.1(301%)	136.16±5.2(160%)	96.14±4.6(95%)

Примечание: В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в%) при действии ИФР-1

В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис. 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5 мин составляет +256%, по сравнению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+236%) (рис. 1).

В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сравнению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис. 3; Таблица 2). Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2; Рис. 3).

Рис. 2. Концентрация инсулина 10^-8М. Различия достоверны (р<0.05)

Таблица 2.Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	110.21±10.8(100%)	125.31±9.3(100%)	106.04±6.6(100%)
+ ИФР-1	259.92±11.4(269%)	229.31±5.2(183%)	103.81±5.8(98%)

Примечание – как в таблице 1.