Было исследовано влияние ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл. 6).
Таблица 6.Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска
| Воздействия | Животные | |
| Крыса | Моллюск | |
| Активность АЦ (%) | ||
| Контроль | 100±1.01% | 100±1.3% |
| Инсулин (10-8М) | 222±1.3%(+122%) | 186±1.8%(+86%) |
| ГТФγS (10-5М) | 242±1.4%(+142%) | 470±9.4%(+370%) |
| ГИДФ (10-5М) | 236±1.8%(+136%) | 269±4.9%(+169%) |
| ГТФ (10-5М) | 135±1.05%(+35%) | 163±5.1%(+63%) |
| ГДФβS (10-5М) | 95±1.2%(-5%) | 92±2.4%(-8%) |
| Инсулин + ГТФγS | 473±2.5%(+373%)[109%] | 726±20.3% (+626%)[170%] |
| Инсулин + ГИДФ | 399±8.2%(+299%)[41%] | 441±12.3%(+341%)[86%] |
| Инсулин + ГТФ | 277±10.1%(+177%)[20%] | 279±8.4% (+179%)[30%] |
| Инсулин + ГДФβS | 102±5.4%(+2%)[-17%] | 105±4.3%(+5%)[-86%] |
Примечание: в круглых скобках – активирующий АЦ эффект используемых агентов в% по отношению к базальной активности, принятой за 100%. В квадратных скобках – потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %.
Согласно представленным данным, ГТФγS, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФγS, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на +170%, 86% и 30% у моллюсков (табл. 6). ГДФβS же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков.
Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФγS, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФβS свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства.
Таблица 7. Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea
| Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) | ||||
| Воздействия | Скелетные мышцы крысы | Гладкие мышцы моллюска | ||
| Без КТ | +КТ | Без КТ | +КТ | |
| Без пептидов | 39.7±3.4 | 48.5±2.0 | 63.2±4.1 | 69.1±9,6 |
| (100%) | (100%) | (100%) | (100%) | |
| Инсулин | 67.9±3.6 | 48.2±2.7 | 200.5±14.4 | 74.2±7.6 |
| 10-9М | (171%) | (99%) | (317%) | (108%) |
| ИФР-1 | 57.4±2.1 | 43.1±1.6 | 139.2±12.4 | 76.8±7.3 |
| 10-9М | (145%) | (89%) | (220%) | (111%) |
| Без ХТ | +ХТ | Без ХТ | +ХТ | |
| Без пептидов | 39.6±2.6 | 79.7±2.7 | 47.4±3.0 | 94.3±5.6 |
| (100%) | (100%) | (100%) | (100%) | |
| Инсулин | 69.3±2.8 | 105.8±7.4 | 151.7±9.8 | 134.0±7.5 |
| 10-9М | (175%) | (133%) | (320%) | (142%) |
| ИФР-1 | 56.7±4.2 | 106.2±6.5 | 100.0±5.4 | 122.6±8.8 |
| 10-9М | (143%) | (133%) | (210%) | (130%) |
Примечание: В скобках – активность АЦ в%. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.
Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют α-субъединицы Gi и Gs белков.
Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование αi-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что βγ-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на αi-субъединицу и βγ димер в условиях действия коклюшного токсина.
Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через βγ-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.
Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности αs-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.
Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l.
Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1
Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10-9–10-7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10-9–10-7М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.
Таблица 8. Влияние вортманнина (10–9М–10–7М) на стимуляцию ИФР-1 (10–8М) и инсулином (10–8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodontacygnea
| Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка) | ||||||
| объекты | Крысы | Моллюски | ||||
| воздействия | без пептида | ИФР-l | инсулин | без пептида | ИФР-l | инсулин |
| без ворманнина | 21±1.6 | 38.2±1.0* | 41.4±2.3* | 17.8±1.0 | 41.1±2.6* | 24.5±1.0* |
| +вортманнин10–9М | 17.9±2.0 | 9.4±1.3 | 9.7±1.4 | 15.8±2.0 | 14.6±1.3 | 14.2±0.4 |
| +вортманнин10–8М | 16.5±2.3 | 8.6±1.3 | 8.4±1.3 | 14.6±2.3 | 13.9±0.8 | 11.6±1.0 |
| +вортманнин10–7М | 13.2±1.9 | 6.3±0.9 | 6.8±0.8 | 14.3±0.9 | 13.8±1.8 | 7.4±0.5 |
Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.
Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.
Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства
Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС – кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (10-10–10-8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10-8М. В присутствии кальфостина (10-8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации).
Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКСζ, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.
Таблица 9. Влияние антител к ПКСζ на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10-8М) и инсулина (10-8М) в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea
| Активность АЦ ( | ||||||
| Объекты | Крысы | Моллюски | ||||
| Воздейтсвия | Без пептида | ИФР-1 | Инсулин | Без пептида | ИФР-1 | инсулин |
| без антител | 100±4.4 | 253±17 | 247±24 | 100±12 | 307±24 | 255±18 |
| АТ 1:1000 | 104±9.5 | 102±14 | 108±16 | 166±25 | 251±21 | 254±12 |
| АТ 1:100 | 98±8.2 | 95±12 | 103±5 | 163±18 | 327±27 | 237±20 |
| АТ 1:10 | 94±6.8 | 68±3.6 | 88±8 | 145±5 | 403±33 | 238±25 |
Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%.
Антитела к ПКСζ почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9). Таким образом, использование моноклональных антител к ПКСζ показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et а1., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСε из мозга позвоночных.