Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Þ Gi-белок (βγ-димер) Þ фосфатидилинозитол-3-киназа Þ протеинкиназа СzÞ Gs-белок Þ аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника – цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.
В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.
Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы
Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток
Таблица 10.Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток
| Воздействия | Активность АЦ(пкмоль цАМФ/мин/мг белка) | Стимулирующий АЦ эффект в% |
| Базальная | 30.59±1.41 | 100% (базальная) |
| NaF 10-2 М | 178.91±4.15 | 585% (+485%) |
| форсколин 10-5 М | 99.26±3.21 | 324% (+224%) |
| ГИДФ 10-6 М | 111.20±3.48 | 364% (+264%) |
| ГТФ 10-5 М | 82.98±2.92 | 271% (+171%) |
| ЭФР 10-9 М | 168.31±4.75 | 550% (+450%) |
| ИФР-1 10-9 М | 102.14±3.34 | 334% (+224%) |
| Инсулин 10-9 М | 74.89±2.11 | 245% (+145%) |
В скобках – активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в%), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%, стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10).
Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.
Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенный эффект, оцениваемый по включению [14C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-1). Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 100% до 250%).
Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин) на активность АЦ. (Рис. 15-2). Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких концентрациях (10-12-10-9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению [14C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-3).
Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов.
Участие аденилатциклазного сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1
Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим незапрограммированную гибель клеток (апоптоз). В экспериментах использовали культуру клеток E1A+cHa-ras, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») (Bulavin et al., 1999) и культуру клеток Е1А+Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз»). В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 11).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий Е1А+сНа-ras и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10-8М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам. Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 10% сывороткой, так и в среде с 0.5% сывороткой.
Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства – инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что инсулин (10-7М), ИФР-1 (10-8М) и дибутирил-цАМФ (10-9М) оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток E1A+cHa-ras (Плеснева, 2003). Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры E1A+cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов. Обнаружено, что культивирование
Таблица 11.Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток E1A+cHa-ras и E1A+E1B
| Условия | Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка) | ||||||
| In vitro | E1A+cHa-ras (клетки, впадающие в апоптоз) | Е1А+Е1В(клетки, не впадающие в апоптоз) | |||||
| Контроль | Инсулин | ИФР-1 | Контроль | Инсулин | ИФР-1 | ||
| Среда + 10% сыворотка | 33.9±3.4(100) | 48.1±2.1(142) | 56.4±1.3(166) | 4.9±0.5(100) | 14.3±1.2(292) | 17.6±1(359) | |
| Среда + 0.5% сыворотка (апоптоз) | 95,9±3,4(100) | 137,0±9,0(143) | 181,6±8,2(189) | 26.7±0.5(100) | 61.4±1.2(230) | 86.3±2.1(323) | |
| In vivo | E1A+cHa-ras (клетки, впадающие в апоптоз) | Е1А+Е1В (клетки, не впадающие в апоптоз) | |||||
| Контроль | Инсулин | ИФР-1 | Контроль | Инсулин | ИФР-1 | ||
| Среда +10%сыворотка | 4.1±0.29(100) | 6.0±0.9(146) | 12.2±0.5(297) | 5.2±0.3(100) | 8.5±1.0(163) | 11.4±1.3(219) | |
| Среда + 0.5%сыворотка (апоптоз) | 11.0±1.2(100) | 17.2±1.2(156) | 24.8±2.2(225) | 5.8±0.6(100) | 10.0±0.7(172) | 13.6±0.6(234) | |
Примечание. В опытах in vitro гормоны (10-8М) добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АЦ. Время инкубации 2.5 мин. В опытах in vivo инсулин (10-7М) и ИФР-1 (10-8М) добавляли к культурам клеток, время инкубации 5 мин. Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%. Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды.
Трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях (среда+10% сыворотки).
Показано, что только 43% культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0.5% сыворотки) по сравнению с контролем (среда+10% сыворотка, принято за 100%). В экспериментах, когда в среду с 0,5% сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70% (для инсулина: 77%, для ИФР-1: 67%, для дибутирил цАМФ: 66% по сравнению с контролем, принятым за 100%).
Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах.
Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1.
Функциональное состояние АЦ сигнального механизма действия инсулина при сахарном диабете
На основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний (Перцева, 2004) исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных (крысы) и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных (моллюски).
Диабет вызывали однократным введением (i.p.) стрептозотоцина (80 нг/г веса животного). На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс, в 4,2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс. Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков (в 2,5 раза) на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния. Обнаружено при диабете снижение АЦ-стимулирующего эффекта инсулина и его потенцирования гуаниновыми нуклеотидами у крыс и у моллюсков.
Инсулин независимый диабет (2-го типа) вызывали введением новорожденным крысятам (1-2 сут) однократно стрептозотоцина (80 нг/г веса животного). При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина. АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование не проявляется.