Анализ в кабинете врача и на дому (стр. 2 из 3)

1.2 Ферментативная иммунохроматография

Ферментативная иммунохроматография также потенциально может широко применяться для диагностики на дому и в кабинете врача. Этот метод предназначен для определения гаптенов, которые в настоящее время в основном определяют с помощью конкурентных методов иммуноанализа. Ферментативная иммунохроматография напоминает иммуноанализ с ферментативным усилением, однако между ними есть и существенные отличия.

В методах типа EMIT гаптен и конъюгатгаптен – фермент конкурируют между собой за ограниченное количество антител против определяемого соединения. Связывание конъюгата с антителом приводит к изменению ферментативной активности. В общем случае свободный конъюгат активен, а в комплексе с антителом неактивен. Таким образом, чем больше определяемого соединения находится в образце, тем большая доля конъюгата останется несвязанной и тем более высокой будет ферментативная активность.

В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент – гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом – глюкозооксидаза. Глюкозооксидаза при окислении глюкозы генерирует пероксид водорода – субстрат пероксидазы, в результате чего отпадает необходимость включать в состав наборов нестабильные пероксидные реагенты. Сухую полоску фильтровальной бумаги с иммобилизованными на ней антителами против определяемого вещества помещают в раствор пробы и других реагентов. Реагирующие вещества под действием капиллярных сил поднимаются по полоске вверх. Глюкозооксидаза распределяется по длине полоски равномерно, а высота подъема определяемого вещества и конъюгата зависит от их относительных концентраций. После инкубации в течение нескольких минут полоску переносят в проявляющий раствор, состоящий из глюкозы и хромогенного индикатора. В ходе ферментативной реакции образуется окрашенная зона, высота которой пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Следовательно, здесь конъюгат используется только в качестве маркера для определения длины пробега определяемого вещества по полоске, а активность фермента при связывании конъюгата с антителом не изменяется.

Для определения теофиллина с помощью ферментативной иммунохроматографии требуется около 15 мин. Чувствительность, специфичность и точность анализа сравнимы с соответствующими характеристиками метода EMIT. Для проведения анализа не требуется никаких приборов, окрашенная полоска стабильна в течение года при хранении в темноте. Метод можно применять для анализа проб крови, если к первому раствору добавить агент, агглютинирующий эритроциты, например антисыворотку барана. До настоящего времени положительный контроль в таких аналитических системах не применялся.

1.3 Иммуноанализ ссамоудерживанием

Для диагностики на дому и в кабинете врача применяется также так называемый иммуноанализ с самоудерживанием. Как и в иммунофильтрации, в нем использованные жидкости остаются в устройстве для анализа, однако в отличие от последнего в ИАСУ нет необходимости в многочисленных стадиях добавления реагентов и промывки. Принцип ИАСУ, разрабатываемый фирмой BiotopeInc. под торговой маркой BioMAT-EIA™, представлен на рис. 6.5. Основой этого метода являются несмешивающиеся растворы реагентов, расположенные слоями и обеспечивающие последовательное проведение реакций и отделение связанных реагентов от несвязанных insitu. Описана также модификация BioMAT™ с использованием радиоиммуноанализа.

В типичном гетерогенном анализе самый верхний слой содержит связанные с антителами гранулы, предварительно смешанные с ферментным конъюгатом. Гранулы диаметром несколько микрометров позволяют значительно ускорить реакцию антиген – антитело по сравнению с трубками или гранулами больших размеров. Реакцию начинают, вводя пробу в анализатор через самоуплотняющуюся мембрану. После инкубации для обеспечения специфического связывания анализатор недолго центрифугируют, заставляя гранулы пройти через не смешивающийся с водой слой. На этой стадии от гранул отделяется несвязавшийся конъюгат. Далее гранулы попадают в нижний слой, содержащий проявляющий для данной ферментной метки раствор. Появление цвета наблюдается только в нижней части пробирки. Интенсивность окраски можно оценить визуально или с помощью специального колориметра. Стадия центрифугирования занимает не более 1 мин, а все необходимые для анализа реагенты находятся уже в пробирке. В анализатор добавляют только изучаемую пробу. В принципе возможен и внутренний контроль, если в анализатор ввести гранулы, с которыми связано определяемое вещество, причем плотность этих гранул должна отличаться от плотности гранул с антителами. Тогда после центрифугирования на другой высоте появится еще одна окрашенная полоса.

Если центрифугирование по каким-либо причинам нежелательно, то для разделения можно использовать намагниченные гранулы и магнитное поле. Метод BioMAT можно адаптировать и для других, более чувствительных, систем обнаружения, например путем измерения флуоресценции с временным разрешением. В методе BioMAT-FIA™ антитела могут содержать лантанидные метки, которые после связывания с определенными хелатирующими агентами флуоресцируют необычно долгое время. Таким образом, можно подавить влияние собственной флуоресценции пробы. Однако максимальную интенсивность флуоресценции лантанидные комплексы проявляют в неводном окружении, поэтому в обычных методах вводят дополнительную стадию перевода пробы в неводную среду. Эта операция в BioMAT-FIA™ исключается за счет использования экстракционных материалов в гидрофобном слое анализатора.

2. Перспективы и тенденции развития

2.1 Совершенствование методологии

На примере описанных выше подходов и методов можно выделить ряд факторов, существенных для дальнейшего развития аналитических систем для самодиагноза ианализов в кабинете врача. Эти системы должны включать внутренний контроль, давать легко интерпретируемые результаты, не требовать точного пробоотбора и строгого контроля по времени.

Для таких систем внутренний контроль особенно важен, поскольку здесь невозможны контроль качества анализов и специальные проверочные схемы. Внутренний контроль обеспечивает потребителю как надежность результата анализа, так и данные о сохранности реагентов.

В некоторых случаях, например при диагностике беременности или инфекционных заболеваний, достаточно качественного результата. В наборах TestPack™ фирмы Abbot на hCG и стрептококки группы А знак «плюс» соответствует положительному результату, а знак «минус» – отрицательному результату. Отсутствие какого-либо знака свидетельствует о неправильном проведении анализа.

Внастоящее время активно разрабатываются аналитические системы, не требующие точной дозировки реагентов. Приспособление для отбора проб в наборе BioMAT™, позволяющее выполнять количественное определение, по-видимому, является наиболее ярким примером этой тенденции. В других аналитических системах, в которых приемлем качественный или полуколичественный результат, для дозировки реагентов используются флаконы-капельницы и некалиброванные пипетки.

Независимость конечного результата от длительности отдельных операций особенно важна в кабинете врача, поскольку обслуживающий персонал может выполнять несколько функций и для него трудно точно выдерживать время каждой операции. Учитывая этот фактор, фирма Biofope разработала модифицированный вари-' ант анализатора BioMAT™, в котором длительность операций инкубации и промывки находится под термоконтролем. Материал промывочного слоя в этом анализаторе твердый при комнатной температуре, но плавится при нагревании до 37°С и таким образом открывает доступ к плотным гранулам. Такие фазовые изменения позволяют автоматизировать стадии инкубации, промывки и цветной реакции, причем необходимость в переносе каких-либо частей системы или жидкой фазы отпадает, а время операций определения регулируется самой аналитической системой.

2.2 Этические проблемы

Дальнейшее развитие самодиагноза и диагноза в кабинете врача связано с решением многочисленных вопросов этики и безопасности. Лица, не имеющие специальной подготовки, могут безоглядно положиться на результаты используемых ими наборов для самодиагноза invitro. При этом ложный отрицательный результат приведет к тому, что больной не получит вовремя соответствующей квалифицированной медицинской помощи. Ложный положительный результат может оказать влияние на психическое состояние пациента. Таким образом, наборы для самодиагноза не устраняют принципиальных различий между самотестированием и самодиагностикой.