Анализ на дому (стр. 2 из 3)

В большинстве наборов для обнаружения беременности, имеющихся в настоящее время в продаже, используются методы типа ELISA, впервые описанные в работе. Этот метод стал активно использоваться в наборах для анализа на дому после появления гибридомной технологии, позволяющей получать в больших количествах специфические, высокоаффинные моноклональные антитела. Во многих из этих методов применяют дипстики, несущие антитела одного типа, и конъюгаты антител второго типа с ферментом в качестве метки. Мембраны могут быть изготовлены в виде полосок из полистирола или из специальной бумаги на пластиковой подложке. Если меткой является щелочная фосфатаза, то используют цветную реакцию с субстратом, например 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфатом, в результате которой на твердой фазе образуется нерастворимый продукт голубого цвета. В случае пероксидазы хрена, как правило, применяют цветные реакции в растворе.

В этих методах достигается чувствительность около 50 ед./л, что примерно соответствует концентрации hCG в момент ожидаемой менструации. Преимущество методов типа ELISA состоит в высокой чувствительности и однозначности результата анализа. В качестве примера на рис. 1 изображен набор Clearblue™. Здесь же дано краткое описание принципа действия набора.

Clearblue™ является единственным набором, в котором максимально упрощен даже отбор проб, а все реагенты поставляются в виде готовых к употреблению растворов. В набор входят специальные стержни, на наконечниках которых сорбированы моноклональные антитела против S-субъединицы hCG. Специальный колпачок закрывает наконечник. Вместе они образуют оригинальное устройство для отбора проб. При введении этого устройства в поток мочи происходит отбор требуемого количества пробы. Весь hCG в пробе связывается с антителами. После этого колпачок снимают, наконечник промывают под струей воды и помещают в лунку с антителами анти-hCG, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Если в пробе содержится hCG, то конъюгат антитело – фермент также связывается на поверхности наконечника. Далее наконечник промывают и помещают во вторую лунку, содержащую БХИФ. При наличии в моче hCG в результате образования производного индиго на поверхности твердой фазы появляется голубая окраска.

Все растворы находятся в одном блоке, а в ходе анализа нет необходимости в переносе проб мочи. Для получения результата в течение 30 мин женщине необходима только водопроводная вода.

В последние годы в методе типа ELISA применяют микропористые мембраны. Микропористые мембраны позволяют сократить время анализа до 5 мин благодаря высокой концентрации антител и большой величине отношения площади поверхности к объему, в результате чего резко снижается роль диффузионного фактора во взаимодействии реагентов. Иными словами, короткий диффузионный путь обеспечивает быстрое связывание иммунохимических реагентов с твердой фазой. Кроме того, в присутствии избытка реагентов реакция связывания протекает по псевдопервому порядку. Возможно, что в ближайшем будущем такие методы будут использовать в наборах для диагноза на дому. Методы с микропористыми мембранами выгодно отличаются очень малой продолжительностью анализа и возможностью использования положительного контроля, как, например, в наборе AbbottTestpack™. К недостаткам таких методов относятся их многостадийность и необходимость добавления определенного количества реагентов с помощью пипетки.

4.2 Овуляционныетесты

Вслед за разработкой и производством иммуноаналитических наборов для определения беременности на дому были разработаны различные варианты ELISA и для определения изменения уровня LH в моче с целью предсказания овуляции.

4.2.1 Клинические и биохимические основы

От одной шестой до одной десятой всех супружеских пар обращаются к врачу в связи с проблемой субфертильности. Субфертильность можно определить как неспособность забеременеть после года нормальной половой жизни без применения противозачаточных средств. Причины субфертильности могут быть разными, но вероятность оплодотворения можно существенно повысить за счет определения наиболее фертильного периода.

До последнего времени единственными домашними методами определения наиболее фертильного периода женского цикла были регистрация изменения температуры базального тельца или изменения эластичности и объема шеечной слизи. Оба этих метода показывают, что овуляция может произойти или уже произошла, но они очень ненадежны в различных физиологических и патологических ситуациях. Если указанные методы используются правильно и достаточно долго, то шансы на возникновение беременности могут увеличиться. Теоретически можно показать, что выбор оптимального момента для полового акта повышает вероятность беременности. Критическим событием, предшествующим овуляции, является выброс в кровь LH. Этот процесс можно использовать для деления овариалыюго цикла на фолликулярную и лютеальную фазы. Во время фолликулярной фазы LH и FSH высвобождаются из гипофиза в небольших количествах и стимулируют созревание трех-четырех фолликулов внутри яичника. Впоследствии один из фолликулов становится доминирующим и начинает секретировать все большие количества эстрогена. По достижении на короткое время определенного критического уровня эстрогена в крови через положительную обратную связь с гипоталамусом резко увеличивается секреция LH. Секреция LH в середине цикла стимулирует разрыв фолликулярных мембран и высвобождение созревшего ооцита. Считают, что яйцеклетка способна к оплодотворению в течение 12–14 ч, а сперматозоиды остаются жизнеспособными в женском воспроизводительном тракте по крайней мере в течение 3 дней. После секреции LH женщина потенциально фертильна в течение 1–2 дней. Во время лютеальной фазы цикла пустые фолликулы образуют структуру, называемую corpusluteum, которая секретирует прогестерон и эстроген. Если оплодотворение произошло, то зародыш имплантируется в эндометрий и секреция прогестерона продолжается еще в течение 12 недель. Если яйцеклетка не оплодотворена, то corpusluteum распадается и уровень циркулирующего прогестерона падает. Тогда эндометрий разрушается, и начинается новый менструальный цикл. Первый день менструального кровотечения можно считать началом нового цикла.

Начинать определение LH в моче следует, согласуясь с длительностью и особенностями менструального цикла. Желательно начинать анализ за 2–3 дня до ожидаемой овуляции, которая у женщин с нормальным циклом наступает через 12–16 дней после менструации. Дата начала тестирования должна быть равна продолжительности цикла минус 17. В случае нерегулярных циклов для определения начальной даты необходимо брать время наиболее короткого цикла. Очевидно, что из-за проблем, связанных с вычислением продолжительности менструального цикла, нерегулярностью овариальных циклов, а также необходимостью получения достоверной базовой линии, результаты тестирования будут тем надежней, чем больше будет проведено анализов.

В последние два года разработано несколько наборов для определения времени овуляции на дому и в клиниках. За исключением набора Discretest™, который основан на методе SPIA, во всех остальных наборах применяются методы типа ELISA. Основные характеристики этих наборов приведены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительные характеристики наборов для самодиагноза, выпускаемых в Великобритании и предназначенных для обнаружения повышения концентрации LH в крови как критерия овуляции

Компания, выпускающая набор,		и название набора
Параметр	Unipath/Oxford	(Mab's Inc.)8	Tambrands (Hygeia)	Quidel	Chefaro
Clearplan	Ovustick/selftest	First response	Quest	Discretest
Метод	ELISA	ELISA	ELISA	ELISA	Агглютинация
Метка	Щел. фосфатаза	Щел .фосфата за	Пероксидаза хрена	Щел .фосфатаза	Золь золота
Твердая фаза	Полистирольный	Пластиковая	Пластиковая	Пластиковая полоска с бумажным верхом (для анализа и контроля)	Золь золота
дипстик	карточка	карточка
(цилиндрический)
Отбор пробы	Утром или	Между 10 и 20 ч;	Рано утром		Рано утром	Рано утром
поздно вечером	рекомендуется в середине дня
Прибор для		Имеется	Нет	Нет	Нет	Нет
отбора пробы
Число анализов,	10	(а) 6	(а)3	5	7
которое позволяет	(6)9	(6)6
ныполнить набор
Продолжительность	30	60	20	<35	30
анализа, мин
Время от сигнала	24-36	24-36	12-24	2044 (США)	24
до овуляции, ч	20-36 (Франция)
Положительная	Голубой цвет на дипстике	Голубой цвет на карточке	Зелено-голубой цвет жидкости в пробирке	Голубой цвет на бумажной цолоске	Исчезновение розовой окраски в пробирке
реакция
Форма хранения результатов	Коллекция дипстиков	Сравнение интенсивности карточек		Интенсивность окраски - запись на трафарете	Запись результата на листке бумаги	Оценка потери интенсивности окраски
Точность,	>98		93		66 при 6 анализах		87 - один анализ	66 - определение
%	(увеличение LH)	(овуляция)	85 при 9 анализах	93 - два анализа	овуляции,
(овуляция)	100 - три анализа в день	99 - точность

В наборе Clearplan™ используется двухстадийный ELISA, и конструктивно он аналогичен набору Clearblue™. Большинство применяемых в настоящее время тестов на овуляцию имеет примерно одинаковую чувствительность определения LH. Поскольку в методе ELISALH определяют по появлению окраски, а в гомогенном методе SPIA– по ее исчезновению, то первый позволяет определить меньшие концентрации и момент начала секреции LH. Один набор позволяет выполнить от 5 до 10 анализов. Набор Clearplan™ рассчитан на 10 анализов и поэтому эффективен даже при нерегулярных циклах и обеспечивает контроль нескольких регулярных циклов. Способ регистрации результатов также изменяется от ответа типа «да – нет» до шкалы интенсивности цвета.