Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових робіт, серед яких 8 журнальних статей у спеціалізованих виданнях, рекомендованих ВАК України (4 - одноосібно). Одержано 3 патенти України. Надруковано 4 тез у матеріалах з’їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 163 сторінках і складається з введення, огляду літератури, розділу "Матеріал, моделі та методи дослідження", 3 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел. Одержані дані представлені в 17 таблицях, ілюстровані 48 рисунками. Бібліографія включає 266 джерел, з яких 169 представлені кирилицею, 97 - латиницею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали моделі та методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені експериментальні дослідження на 120 статевозрілих щурах-самцях и 180 статевозрілих щурах-самках лінії Wistar вагою 190-250 г. Лабораторних тварин утримували в умовах акредитованого віварію ВДНЗУ «УМСА» на типовому раціоні годування (раціон 3.2 згідно наказу 1179 про нормативи годування лабораторних тварин в закладах охорони здоров’я). Групування дослідів подане в табл. 1. Моделювання хронічної інтоксикації відтворювали внутрішньошлунковим введенням тваринам ацетату свинцю на фізіологічному розчині дозою 60 мг/кг маси тіла [А.І. Штенберг, 1983], або клопіраліду в дозі 150 мг/кг один раз на добу, експеримент тривав протягом 56 діб [C. Felkner, 1982]. Усі експериментальні досліди були проведені під контролем комісії з біоетики ВДНЗУ «УМСА» (протокол №36 від 25.04.06).
Евтаназію щурів здійснювали під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно) після добового голодування. У хронічних експериментах використовувались антиоксидантні препарати: a-токоферолу ацетат; екстракт ехінацеї пурпурової рідкий, азупростат на протязі 56 діб. Шлях введення і дозування АО подані в табл. 1. Дози препаратів АО відпрацьовані в лабораторії біохімії і фармакології антиоксидантів ВДНЗУ «УМСА» [В.М. Бобирьов, 1990], при цьому враховувалась мета дослідження – вивчення дії АО, як гонадопротекторів.
| Таблиця 1 | |||
| Групування експериментів на щурах | |||
| №се- рії | Прооксидант.Добова доза мг/кг маси тіла,шлях введення | Кіль-кістьтварин | Препаратдобова доза мг/кг маси тіла,шлях введення |
| 1 | Інтактні | 10 | - |
| 2 | Інтактні | 10 | фізіологічний розчин, 1мл, per os |
| 3 | Ацетат свинцю, 60 мг/кг per os | 20 | - |
| 4 | Ацетат свинцю, 60 мг/кг per os | 10 | a- токоферолу ацетат, 10 мг/кг, per os |
| 5 | Ацетат свинцю, 60 мг/кг per os | 10 | Екстракт ехінацеї пурпурової рідкий, 5 мг/кг, per os |
| 6 | Ацетат свинцю, 60 мг/кг per os | 10 | Азупростат, 30 мг/кг, per os |
| 7 | Клопіралід, 150 мг/кг per os | 20 | - |
| 8 | Клопіралід, 150 мг/кг per os | 10 | a- токоферолу ацетат, 10 мг/кг, per os |
| 9 | Клопіралід, 150 мг/кг per os | 10 | Екстракт ехінацеї пурпурової рідкий, 5 мг/кг, per os |
| 10 | Клопіралід, 150 мг/кг per os | 10 | Азупростат, 30 мг/кг, per os |
Основними об'єктами дослідження у експериментальних тварин були кров, тканина сім’яників і сперма. У крові і тканинах сім’яниківекспериментальних тварин досліджували біохімічні показники: дієнові кон’югати (ДК) в сироватці [О.М. Воскресенский, В.А. Дельва, 1982], ТБК-реактанти в сироватці та сім’яниках [Ю.А. Владимиров, А.І. Арчаков, 1972], Спонтанний гемоліз еритроцитів (СГЕ) [В.В, Спиричев, И.И. Матусин, 1970], активність супероксиддисмутази (СОД) в крові [О.С. Брусов, А.М Герасимов, 1976], каталази в крові [О.Г. Архипова, 1995], вміст церулоплазміну [В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1976]. В тканинах сім’яників визначали джерело активних форм кисню (АФК) (in vitro) [О.І. Цебржинський, 2002].
Проводили морфометрічні досліди з визначенням маси сім’яників та масового коефіцієнту [Г.Г. Автанділов, 1990]. Оцінювали морфологічний стан сперматогенного епітелію, на зрізі сім’яника у кожному канальці визначали кількість шарів сперматогенного епітелію, кількість канальців з 3 і 4 шарами епітелію, обчислювали індекс сперматогенезу [І.В. Саноцкій, 1979; О.В. Стефанов, 2001]. Крім того визначали кількість: нормальних сперматогоній, канальців з 12 стадією мейозу, канальців із злущеним сперматогенним епітелієм, канальців з атрофічним або пошкодженим епітелієм [Ю.І. Ухов, 1983; Д.С. Саркисова, 1996]. Зрілі сперматозоїди вилучали з придатку та підраховували кількість сперматозоїдів, життєздатність сперматозоїдів визначали за допомогою еозинового тесту, підраховували кількість живих та мертвих клітин. Визначали кількість патологічних форм сперматозоїдів [Ю.В. Іванов, 1983]. Також оцінювали рухливість сперматозоїдів: підраховували відсоток клітин з швидкою поступальною ходою (50 мм/сек) - нормокінезис, сповільненою поступальною ходою – гіпокінезис (менше 40 мм/сек), нерухомих - акінезис, і безладними рухами, що коливаються, - дискінезис [М.А. Базарнова, 1988].
Для визначення репродуктивної здатності самців їх спарювали з інтактними самками у співвідношенні 1:5. На 21-й день вагітності самок виводили з експерименту, для кожної самки підраховувалися: загальна кількість жовтих тіл в яєчниках; кількість місць імплантації; кількість живих плодів; кількість мертвих ембріонів; кількість резорбованих зародків і плодів [Н.Р. Шепельська, 2001]. Виходячи з даних показників, обчислювали загальну ембріональну і постімплантаційну летальність [Т.І. Харченко, 1988].
Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою комп’ютерного пакета програм «Exell» та «Statistica for Windows. Release 6.0», розробленою фірмою StatSoft з використанням t критерія Ст’юдента та кореляційного аналізу по Спірману. Достовірно різними вважались результати при p<0,05.
Результати дослідження та їх обговорення. При хронічному введенні щурам прооксиданту - ацетату свинцю спостерігалася індукція ВРПО ліпідів, що супроводжується підвищенням рівня первинних і проміжних продуктів ВРПО ліпідів в крові і тканинах сім’яників (рис. 1), падінням антиоксидантної забезпеченості організму піддослідних тварин (р<0,05). У тварин на тлі падіння активності каталази (р<0,02) і вмісту церулоплазміну (р<0,01), спостерігалося індуктивне підвищення активності СОД (р<0,001). Це призводило до морфологічних порушень в сім’яниках у вигляді атрофії сперматогенного епітелію, порушення його диференціювання, набряку межуточної тканини, запальної інфільтрації межуточної тканини, спустошення сім’яних канальців, ушкодження сперматогенного епітелію, зниження індексу сперматогенезу і кількості сперматозоїдів, збільшення кількості патологічних форм сперматозоїдів, форм з гипо- і дискінезисом (табл. 2). Порушення репродуктивної функції щурів самців приводили до істотних розладів ембріо- і фетогенезу у спарених з ними інтактних самок (рис. 2).
Аналогічні, але виражені більшою мірою, зміни спостерігалися при хронічному введенні клопіраліду. Виявлялась активація ВРПО ліпідів в організмі, і зниження рівня гідрофобних АО. У крові та тканинах сім’яників достовірно збільшувався рівень ТБК-реактантів. У крові тварин наростала концентрація ДК (р<0,01) (рис. 3), зростання рівню СГЕ (р<0,05), прогресивно знижувалася активність каталази (р<0,05) і вміст церулоплазміну (р<0,01), на тлі збільшеної активності СОД (р<0,001). Відмічалось спустошення сім'яних канальців, ураження сперматогенного епітелію особливо на кінцевих етапах сперматогенезу, некроз канальців сім’яників. Що, призводило до зниження індексу сперматогенезу, функціональної здатності сперми, зростання патологічних форм сперматозоїдів, порушення їх рухливості (див. табл. 2). Спостерігалися порушення ембріо- і фетогенезу у спарених з ними інтактних самок, знижувалася кількість місць імплантації і живих ембріонів, збільшувалося число мертвих і резорбованих зародків, підвищувалася загальна і постімплантаційна ембріональна летальність (рис. 4).
Аналіз виявлених змін свідчить, що дія ацетату свинцю призводила до більш вираженої інтенсифікації ВРПО ліпідів у крові, а клопіраліду - в тканинах сім’яників, що, вочевидь, обумовлено тропністю прооксидантів до відповідних тканин. Дія обох прооксидантів призводила до дискоординації між інтенсивністю ВРПО і антиоксидантною забезпеченістю, що супроводжувалося порушенням окислювальних процесів і активності АФ. Визначення генерації АФК в тканинах сім’яників свідчить, що провідний внесок в продукцію супероксиду в сім’яниках при дії ацетату свинцю дає мітохондріальне окислення, а вплив клопіраліду стимулює витік супероксиду з мікросомального електронно-транспортного ланцюга.
В цілому одержані дані свідчать про те, що за рахунок прооксидантних ефектів клопіраліду і ацетату свинцю спостерігалося зниження запліднюючої здатності сперми. Що підтверджувалось результатами проведеного кореляційного аналізу. У щурів, що одержували ацетат свинцю, виявлений тісний зворотний взаємозв'язок між рівнем СГЕ, що відображає забезпеченість організму гідрофобними АО, і індексом сперматогенезу r=-0,78. Рівень продуктів ВПРО ліпідів ТБК-реактантів в сім’яниках корелює з кількістю сперматозоїдів з дискінезісом r=0,78, та з кількістю канальців з атрофічним або ушкодженим епітелієм r=0,80. Підтверджує ці закономірності
Рис. 1. Зміст ДК в сироватці крові та ТБК-реагуючих продуктів в тканинах сім’яників тварин, що отримували препарати АО на тлі введення ацетату свинцю.
В рис. 1-4: * - достовірність порівняно з інтактною групою;
** - достовірність порівняно з контрольною групою.
Рис. 2. Кількість живих, мертвих и резорбованих ембріонів у інтактних самок спарених с самцями, що отримували препарати АО на тлі введення ацетату свинцю.
Виявлений зворотнийкореляційний зв'язок між рівнем ТБК-реактантів з кількістю нормальних сперматогонієв r=-0,81.