Мета і завдання дослідженя. Метою роботи було дослідити взаємозв’язок між антигенною специфічністю та особливостями каталітичної активності ауто-АТ клінічно здорових людей та хворих на аутоімунні захворювання, а також вивчити їхній вплив на ріст і виживання клітин ссавців invitro.
Для досягнення цієї мети було проведено дослідження у 3-х основних напрямках:
Порівняти антигенну специфічність та каталітичну активність ауто-АТ, виділених із сироватки крові здорових донорів та хворих на системний червоний вовчак і розсіяний склероз, із ауто-АТ, виділеними із молозива та молока клінічно здорових жінок.
Проаналізувати спорідненість синтетичних та природних чинників, здатних утворювати комплекси із ауто-АТ сироватки крові і молока людини, та дослідити їхній вплив на каталітичну активність абзимів.
Отримати очищені препарати антитіл із різною антигенною специфічністю із сироватки крові та молока людини і дослідити їхній вплив на ріст та виживання клітин invitro.
У межах цих напрямків дослідження у роботі вирішували наступні завдання:
Дослідити вплив препаратів імуноглобулінів, отриманих із сироватки крові здорових донорів, хворих на розсіяний склероз і молозива породіль, на ріст і виживання клітин invitro.
Розробити методи очистки ауто-АТ та абзимів із сироватки крові та молока людини.
Визначити антиген-зв’язувальні, каталітичні та регуляторні центри ауто-АТ та абзимів із використанням афінної модифікації молекул АТ реакційно здатними аналогами нуклеотидів та олігонуклеотидів.
Вивчити закономірності регуляції каталітичної активності абзимів сироватки крові та молока людини:
а) за допомогою різних речовин біологічного походження (нуклеотиди, ДНК, РНК, полісахариди, конкурентні інгібітори протеїназ);
б) за допомогою синтетичних речовин (модифіковані аналоги нуклеотидів та олігонуклеотидів, хімічні модифікатори амінокислотних залишків білків).
Встановити закономірності впливу ауто-АТ та абзимів, виділених із сироватки крові клінічно здорових людей та молока породіль, на ріст та виживання ракових і трансформованих клітин invitro.
Об’єкт дослідження – аутологічні антитіла сироватки крові і молока людини.
Предмет дослідження – виявлення і очистка аутологічних антитіл різної антигенної специфічності із сироватки крові і молока людини та дослідження їхньої функціональної активності, зокрема, впливу на ріст і виживання клітин.
Методи дослідження. У роботі використано методи препаративної та аналітичної біохімії білків і нуклеїнових кислот (осадження білків сульфатом амонію, діаліз, іонообмінна хроматографія, електрофорез у поліакриламідному та агарозному гелі, ізоелектричне фокусування білків, високоефективна рідинна хроматографія). Проведено комп’ютерний аналіз рівня гомології між первинними структурами протеїнкіназ та білків надродини імуноглобулінів. Застосовано методи дослідження цитотоксичної дії чинників на клітини ссавців invitro (визначення кількості живих і мертвих клітин у культурі, виявлення апоптозу електрофоретичним аналізом нуклеосомної фрагментації ДНК та електрофорезом індивідуальних клітин у гелі агарози (метод ДНК-комет)). Крім того, застосовано імунологічні методи (імуноензимний і цитохімічний аналіз антигенної специфічності антитіл молока людини), а також методи статистичної обробки результатів дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. На основі розробленої схеми очистки антитіл із заданою антигенною специфічністю із сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання (системний червоний вовчак (СЧВ), розсіяний склероз) та молока клінічно здорових жінок уперше очищено каталітично активні антитіла (абзими) класу IgG та IgAзі спорідненістю до АТР (анти-АТР АТ), дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ) і гістону Н1 (антигістонові АТ). Встановлено, що анти-АТР АТ сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і молока клінічно здорових жінок володіють фосфотрансферазною (протеїнкіназною і ліпідкіназною) активністю, анти-ДНК АТ молока людини володіють РНК-азною, ДНК-азною та протеїнкіназною активністю, тоді як антигістоновим АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль властива протеазна активність щодо деяких лужних білків.
Вперше виявлено чинники, які впливають на каталітичну активність абзимів. Показано, що дезоксирибоолігонуклеотиди стимулюють протеїнкіназну активність sIgA-абзимів молока людини, тоді як нуклеотидтрифосфати інгібують їхню нуклеазну активність.
Виявлено, що імуноглобуліни сироватки крові та молока клінічно здорових людей індукують загибель клітин лейкемії шляхом апоптозу. Разом із тим, у сироватці крові окремих хворих на розсіяний склероз присутні імуноглобуліни, здатні індукувати проліферацію лейкемічних клітин людини.
Теоретичне значення одержаних результатів. Вперше обґрунтовано механізм промітогенної дії IgG-абзимів на клітини ссавців, а також механізм каталізу антитілами фосфотрансферазної реакції. Запропоновано модель внутрішньоклітинної нейтралізації вірусів у епітеліальних клітинах за участю sIgA-абзимів.
Практичне значення отриманих результатів. У роботі проведено аналіз антигенної специфічності, каталітичної та цитотоксичної активності імуноглобулінів, отриманих із молозива клінічно здорових породіль. На основі отриманих результатів зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості важливо врахувати під час комплексного визначення показників ранніх аутоімунних порушень у жінок, пов’язаних із їхньою вагітністю та пологами.
Особистий внесок здобувача. Авторові належить формулювання теми й мети досліджень, вибір об’єктів, а також вибір і розробка методів дослідження, постановка експериментів. Експериментальні визначення, обробка даних, їхній теоретичний аналіз виконані автором самостійно, або за його безпосередньою участю. Автором проведено аналіз даних літератури за темою роботи, сформульовано та обґрунтовано висновки та узагальнення.
Науковим консультантом здійснювалося загальне керівництво проведенням досліджень та обговорення отриманих результатів у період роботи дисертанта в Інституті біології клітини НАН України.
Апробація одержаних результатів. Основні результати дисертації обговорювались на ІІ міжнародній конференції “Catalytic Antibodies and Antibody Engineering” (Шантілі, Франція, 1996); X міжнародному імунологічному конгресі (Нью-Делі, Індія, 1998); Кістоунському симпозіумі з молекулярної і клітинної біології (Брекенрідж, США, 1999); III Парнасівській конференції “Mechanismsofcellularsignaltransductionandcommunication” (Львів, 2000); Міжнародній конференції “RNAasTerapeuticandGenomicTarget” (Новосибірськ, Росія, 2001); конференції НАТО “Frontiersinautoimmunity: fundamentalaspectsandclinicalperspectives” (Кеслей, Угорщина, 2002); Установчому з’їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (Київ, 2005); XI Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006); ІІІ Міжнародній конференції “Фундаментальные науки – медицине” (Новосибірськ, Росія, 2007); ІІ з’їзді українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 38 наукових робіт, із них 25 статей у фахових вітчизняних і міжнародних журналах, 1 огляд та тези 12 доповідей на наукових конференціях.
Зміст та обсяг роботи. Дисертація включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи, результати власних досліджень, що складаються із 9 розділів, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаної літератури, який нараховує 300 найменувань. Текст дисертації викладено на 290 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 118 рисунками і 5 таблицями.
Матеріали і методи дослідженя. Отримання електрофоретично гомогенних препаратів антитіл є однією із найбільш важливих умов дослідження їхньої функціональної активності. У першу чергу, це стосується каталітично активних антитіл, які володіють аналогічною із ензимами каталітичною активністю. Виділення та очистка абзимів є досить складним завданням. Це зумовлено сукупністю факторів. Відомо, що сумарні препарати імуноглобулінів є поліклональними, складаються із різноманітних за ізотипом антитіл, які мають спорідненість до великої кількості різноманітних антигенів, серед яких є й ензими. Останні можуть знаходитися у комплексі із антитілами, що може бути причиною артефактів при дослідженні їхньої каталітичної активності. Тому на перших стадіях очистки ауто-АТ необхідно відділити антитіла від різноманітних антигенів, у першу чергу від білків. Наступним кроком повинно бути виділення фракції антитіл, яка володіє спорідненістю до антигену – потенційного субстрату каталітичної реакції.
На рис.1 наведено узагальнену схему очистки ауто-АТ із сироватки крові та молока людини, яка дозволяє отримати препарати антитіл із заданою антигенною специфічністю, збагачені каталітично активними антитілами.
На першій стадії очистки імуноглобуліни осаджували 50% сульфатом амонію. Це дозволяє відділити фракцію імуноглобулінів від основної маси білків сироватки крові чи молока. Наступна стадія включає афінну хроматографію на колонці, яка містить протеїн A - або протеїн G - агарозу (або сефарозу). Для видалення домішок колонки промивали розчинами із підвищеною концентрацією NaCl (0,3–0,5 М) у присутності неіонних детергентів (NP-40, тритон Х-100). Елюцію імуноглобулінів із колонки проводили буфером із низьким значенням рН (1 M оцтова кислота або 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6). Використання цих сорбентів дозволяє уже на перших стадіях очистки отримати препарати, які на 90-95% складаються із імуноглобулінів. Для подальшої очистки антитіл або їхнього розділення на субкласи (наприклад, sIgAта IgG молозива) використовували іонообмінну хроматографію або напівпрепаративну гель-фільтрацію (Невинский та ін., 2000). Препарати антитіл, очищені таким методом, є електрофоретично гомогенними (рис.1А, Б) і придатні для виділення антитіл зі спорідненістю до певних антигенів чи субстратів каталітичної реакції.