Отримані препарати імуноглобулінів у подальшому слугували для виділення моноспецифічних поліклональних антитіл із сироватки крові і молока людини афінною хроматографією на колонках, які містять сорбенти із ковалентно зв’язаними лігандами. Сорбентами слугували: АТР-сефароза, ДНК-целюлоза, гістон Н1-сефароза. Залежно від спорідненості до сорбентів, антитіла елюювали градієнтом концентрації 0–1 М NaCl (анти-АТР IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак), 3,5 MMgCl2 (анти-АТР sIgA молозива породіль), 50 мМ NaOH (анти-ДНК sIgA молозива породіль), 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 (антигістонові АТ субкласів IgGта sIgA сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива породіль).
Визначення протеїнкіназної активності. Для аналізу протеїнкіназної активності АТ і rsCD4 донором фосфату був [g-32P] ATP (5000 Ki/ммоль, “Изотоп”, Російська Федерація). Реакційне середовище містило 0,3 – 3 мкг білка,20 мМ трис-HCl, рН 7,4, 5-10 мМ MgCl2, 25 мкКі [g-32P] ATP. У деяких випадках, у реакційне середовище додатково додавали АТР, казеїн коров’ячого або людського молока. Реакцію фосфорилювання проводили впродовж 30 хв при 37 °С і зупиняли додаванням денатуруючого розчину (65 мМ трис-HCl, рН 6,8, 1% Ds-Na, 2% 2-меркаптоетанол, 10% гліцерин) або 10% ТХО. Білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ, або у градієнті 6-16,5% ПААГ у присутності 0,1% DS-Na. Гелі фарбували CoomassieR-250, висушували і піддавали авторадіографії протягом 20 год.
Визначення ліпідкіназної активності. Для аналізу використовували препарати IgGі sIgA різного ступеня очистки. Реакцію фосфорилювання проводили у середовищі, яке містило 20мM трис-HCl, pH 7,5, 3 мМ MgCl2 і 20 мкКі [g-32P] ATP.32Р-мічені ліпіди екстрагували розчином хлороформ: метанол (2: 1) і розділяли на пластині Kieselgel 60 у системі хлороформ: метанол: 7М NH40H (60: 35: 5). Пластину висушивали і піддавали авторадіографії.
Визначення нуклеазної активності. Нуклеазну активність імуноглобулінів визначали згідно раніше описаної методики (Shusteretal., 1992). Як субстрат використовували надспіралізовану та лінійну форми плазмідної ДНК, тотальну РНК E. coli або рибосомну РНК клітин аденокарциноми людини лінії A549. Для аналізу зразки, які містили 1-5 мкг білка, інкубували із 3-5 мкг нуклеїнових кислот у 20 мМ трис-HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 протягом 1 год при 37 °С. Ефекторами реакції слугували 0,1-3 мМ АТР або 1 мМ GTP, СТР, TTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Продукти реакції розділяли електрофорезом у 1% агарозі у трис-борат-ЕДТА буфері, рН 8,3у присутності 0,001% бромистого етидію. Гель фотографували при ультрафіолетовому освітленні.
Визначення протеазної активності. Для аналізу протеазної активності АТ субстратами слугували гістони тимусу теляти і цитохром С („Fermentas”, Литовська Республіка). Реакцію гідролізу проводили у буфері, який містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5 у присутності 3 мг/мл білка і 0,05 – 0,3 мг/мл АТ упродовж 1-3 год при 37 °С. Реакцію зупиняли додаванням у реакційне середовище 4-кратного денатуруючого буферу (0,2 М трис-HCl, рН 6,8, 4% Ds-Na, 8% 2-меркаптоетанол, 40% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі фарбували CoomassieG-250.
Аналіз каталітичної активності АТ після розділення гель-фільтрацією за умов дисоціації імунних комплексів (рН-шок). Препарати АТ піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 x 5 мм, яка містила ToyopearlTSKHW-55 („ToyoSoda”, Японія). Білки препаратів АТ попередньо осаджували 50% сульфатом амонію й осад розчиняли в 0,1 М гліцин-HCl, рН 2,6 або 50 мМ NaOH. Елюцію білків проводили цими ж розчинами. Хроматографічні фракції (300 мкл) збирали, нейтралізували і діалізували проти буферу, що містив 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,1 М NaCl протягом 18 год. Вміст білків аналізували електрофорезом у градієнті ПААГ (7 – 18,5%) у присутності 0,1% Ds-Na. Для аналізу каталітичної активності від хроматографічних фракцій відбирали аліквоти (30 мкл), додавали 6 мкг субстрату (плазмідна ДНК, гістон Н1) й інкубували 2 год при 37 °С. Продукти реакції розділяли електрофорезом залежно від природи субстрату.
Афінна модифікація білків реакційно здатними аналогами АТР і олігонуклеотидів. Для виявлення АТР - і ДНК-зв’язувальних ділянок на молекулах білків використовували реакційно здатні похідні АТР(ClR-Р-ppA) і [g-32P] ATP(ClR-32Р-ppA), а також 32Р-мічений 14-мірний дезоксириботимідилат (ClRCH2NHp(T) 14), які були синтезовані к. б. н. Якубовим Л.А. (Інститут хімічної біології і фундаментальної медицини, Новосибірськ, Російська Федерація). Реакційною групою слугувала алкілуюча сполука 4- [(N-2-хлоретил-N-метил) аміно] бензиламін, приєднана до 5'-кінцевої фосфатної групи олігонуклеотиду абоg-фосфату [g-32P] ATP (рис.2).
Афінну модифікацію білків (sIgA, rsCD4) проводили у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР: 0,14 М NaCl, 10 мМ NaН2РО4, рН 7,5) у присутності 10 мкМ алкілуючого реагенту протягом 45 хв при 37 °С. Конкурентами у реакції слугували: ДНК тимусу теляти, сумарна РНК E. coliі гепарин у концентрації 1 мг/мл або 30 мкМ d(T) 14. Після завершення інкубації до реакційного середовища додавали денатуруючий буфер (2% Ds-Na, 50 мМ трис-НCl, рН 6,8, 4% 2-меркаптоетанол, 20% гліцерин) і білки розділяли електрофорезом у 10% ПААГ у присутності 0,1% Ds-Na. Гелі висушували і проводили їхню авторадіографію.
Імуноензимний аналіз (ІЕА). ІЕА проводили згідно описаної нижче методики. Для сорбції антигенів у лунки 96-лункового планшету для імунологічних аналізів вносили 30 мкл розчину, який містив 2 мкг гістонів або дволанцюгову ДНК у 0,1 М K2CO3/KHCO3, pH 8,6, й інкубували протягом 18 год при 4 °С. Лунки промивали (3 рази) 200 мкл буферу А (1% БСА у ЗФР), додавали 15 мкг антитіл у 200 мкл буферу А й інкубували протягом 2 год при 37 °С. Лунки тричі промивали 200 мкл буферу А, додавали 50 мкл розчину кон’югату білок А – пероксидаза хрону ("Sigma", США) у розведенні 1: 500 й інкубували протягом 1 год при 37 °С. Лунки планшету тричі промивали 200 мкл ЗФР у присутності 0,05% Twin-20 і фарбували розчином діамінобензидин/Н2О2 протягом 30 хв при 37 °С. Реакцію зупиняли 1 М ортофосфорною кислотою. Оптичну густину розчину визначали при довжині хвилі 492 нм на спектрофотометрі NanoDrop ND 1000 („NanoDropTechnologies”, США). Рівень ауто-АТ у лунках вираховували за величиною оптичного поглинання розчину забарвлених продуктів пероксидазної реакції. Визначення проводили у трьох паралельних дослідах.
Клітини та їхнє культивування. У роботі використовували клітинні лінії, одержані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України: Jurkat – лейкемічні Т-лімфоцити периферичної крові людини, Namalwa – В-лімфоцити людини (лімфома Беркіта); L1210 – лейкемічні В-лімфоцити миші, L929 – трансформовані фібробласти миші. Клітини культивували у середовищі RPMI-1640 або DMEM(„Sigma”, США) у присутності 10% сироватки крові ембріонів ВРХ („Sigma”, США) і 50 мкг/мл гентаміцину.
Аналіз цитотоксичної активності препаратів антитіл. Клітини інкубували із препаратами АТ (кінцева концентрація 0,7 мг/мл) протягом 24, 48 або 72 год. Фарбування клітин проводили 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незабарвлених живих і забарвлених мертвих клітин підраховували у гемоцитометричній камері під світловим мікроскопом Биолам Р (ЛОМО, Російська Федерація). Індекс життєздатності (IЖ) визначали за формулою: IЖ = O/C x 100, де О – кількість живих клітин у культурі під впливом АТ, С – кількість живих клітин у культурі у відсутності АТ.
Аналіз субклітинної локалізації антигенів ауто-АТ. Клітини відмивали ЗФР від культурального середовища, готували цитологічні мазки, фіксували їх метанолом протягом 90 сек і висушували при кімнатній температурі. Після цього мазки інкубували з препаратами Ig (розведення 1: 75) при 4 °C протягом ночі. Після інкубації мазки промивали ЗФР двічі по 10 хв та інкубували із FITC-міченими IgG кози, специфічними до Н-ланцюгів IgA людини, або кон’югованими із пероксидазою хрону IgGкролика, специфічними до Н-ланцюгів IgG людини („Sigma”, США), у розведенні 1: 50 протягом 1,5 год при 37 °С. Мазки промивали ЗФР, фарбували флуоресцентним барвником DAPI (1 мкг/мл) протягом 1 хв, знову промивали ЗФР, дистильованою водою і фотографували під мікроскопом Микмед К-2-12 („ЛОМО”, Росія) при відповідних довжинах хвилі збудження та емісії для виявлення флуоресценції. У випадку, коли для детекції використовували кон’югати АТ із пероксидазою хрону, комплекси антиген-АТ фарбували розчином діамінобензидин/Н2О2 у присутності 100 мМ NiCl2 протягом 30 хв при 37 °С і виявляли мікроскопією у видимій області спектру.
Виділення фрагментованої ДНК та її електрофорез у гелі агарози. Клітини після культивування із препаратами АТ осаджували центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 5 хв. До осаду клітин додавали 0,5 мл холодного ЗФР та фіксували, поступово додаючи до суспензії клітин 5 мл холодного розчину 70% етанолу. Клітини залишали на 12 год при - 20 °С (деякі зразки зберігали при даній температурі протягом 3-4 тижнів). Після цього клітини центрифугували при 2000 об/хв протягом 5 хв. Осад клітин (2-3 млн. клітин) ресуспендовували у 40 мкл фосфат-цитратного буферу, який містив 192 частини 0,2 М Na2HPO4 та 8 частин 0,1 М лимонної кислоти, рН 7,8, та залишали при кімнатній температурі на 30 хв. Після центрифугування при 3000 об/хв протягом 5 хв надосадову рідину переносили у свіжу пробірку типу Еппендорф та додавали 3 мкл 0,25%водного розчину NP-40 („Sigma”, США) та 2 мкл РНК-ази А (розчин 10 мг/мл у воді). Після 1-годинної інкубації при 37 °С до суспензії додавали 5 мкл протеїнази К („Merck”, Німеччина) (розчин 1 мг/мл у воді) та інкубували 1 год при 37 °С. Після інкубації до препарату ДНК додавали 12 мкл буферу,який містив 0,25% бромфенолового синього, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50% гліцерину і розділялив 1% гелі агарози у присутності 0,005% етидію броміду при напрузі 4 В/см протягом 2 год. Фрагменти ДНК виявляли при ультрафіолетовому освітленні і фотографували цифровою камероюNikonCoolpix 4200.
Мікроелектрофорез ДНК окремих клітин у гелі агарози (метод ДНК-комет). Аналіз здійснювали, як описано (Камінський та ін., 2005). Для формування гелю, предметні скельця покривали плівкою агарози шляхом нанесення 2 мл 1% тугоплавкої агарози („Serva”, Німеччина) і висушування у термостаті при 37 °С.40 мкл суспензії клітин вносили у пробірку типу Еппендорф і поміщали у водяну баню при 40 °С, змішували із 120 мкл розчину легкоплавкої агарози („Serva”, Німеччина) (кінцева концентрація агарози становила 0,75%), швидко наносили на теплі предметні скельця 150 мкл такої суміші і покривали теплим покривним скельцем. Після застигання агарози обережно знімали покривне скельце і вносили у лізувальний буфер (2% лаурил саркозинат, 0,5 М ЕДТА, рН 7,5, 0,3 мг/мл протеїнази К). Гелі інкубувалипри 4о С упродовж 1 год, а потім 20 год при 37 °С. Гелі витримували тричі по 20 хв у буфері ТБЕ (90 мМ трис, 90 мМ борної кислоти та 2 мМ ЕДТА, рН 8,5), після чого вносили в електрофоретичну камеру і заливали цим же буфером (2-3 мм буферу над скельцем). Електрофорез здійснювали при напрузі 0,6 В/см протягом 25 хв, причому електричне поле скеровували поперек предметного скельця. Після лужного електрофорезу препарати нейтралізували у 0,4 М трис-HCl, рН 7,5. Гелі висушували і фарбували водним розчином етидію броміду у концентрації 2 мкг/мл.