Комп’ютерний аналіз рівня гомології послідовностей амінокислот імуноглобулінів і рецептора СD4 та протеїнкіназ. Амінокислотну послідовність рецептора СD4 та Fc-фрагментів імуноглобулінів було отримано із бази даних Swiss-Prot. Для аналізу рівня гомології використовували банк генів протеїнкіназ KinBase та програми порівняння KinomBlastServer (www. kinase. com). Аналіз доменної організації рецептора СD4 проводили, використовуючи базу даних SMART (smart. embl-heidelberg. de) та Pfam (pfam. wustl. edu). Пошук функціональних мотивів молекули СD4 здійснювали, застосовуючи базу даних Scansite та програму порівняння MotifScan (scansite. mit. edu).
Статистична обробка отриманих результатів досліджень. Усі досліди повторювали3-5 разів. У роботі наведено середні значення величин і стандартні похибки (M±m). Статистичний аналіз проводили, користуючись критерієм Ст’юдента (t). Вірогідними вважали дані у випадку, коли р≤0,05. Побудову графіків та статистичну обробку даних здійснювали за допомогою комп’ютерних програм Origin 4.0 та Excel 97.
Вплив препаратів антитіл сироватки крові та молока людини на ріст і виживання Т-клітин лінії Jurkat. Аналіз впливу препаратів сумарних імуноглобулінів (Ig), отриманих із сироватки крові 22 хворих на розсіяний склероз (РС), і 25 зразків молозива клінічно здорових породіль, отриманих осадженням 50% cульфатом амонію, показав, що залежно від донорів, ці препарати можуть як пригнічувати, так і стимулювати ріст Т-клітин лінії Jurkatinvitro (рис.3). На відміну від Igхворих на розсіяний склероз, препарати Ig, отримані із сироватки крові здорових донорів, у більшості випадків пригнічували ріст клітин invitro. Рівень гальмування приросту Т-клітин лінії Jurkat під дією Igздорових донорів був близьким до рівня гальмування приросту цих клітин під впливом Ig хворих на розсіяний склероз. При цьому жоден із 25 препаратів Ig здорових донорів не володів промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Співвідношення кількості живих і мертвих клітин у цьому досліді вказує на те, що деякі препарати Igмолозива породіль володіють цитотоксичною активністю щодо Т - клітин лінії Jurkat.
Гель-електрофорезом індивідуальних клітин (аналіз ДНК-комет), а також електрофоретичним аналізом міжнуклеосомної фрагментації ядерної ДНК встановлено, що загибель Т-клітин лінії Jurkatпід впливом цитотоксичних препаратів Ig молозива породіль відбувається шляхом апоптозу (рис.4).
Наступне дослідження показало, що подібно до Ig молозива породіль, окремі препарати Ig, очищені із сироватки крові хворих на розсіяний склероз і здорових донорів, також індукують апоптоз цих Т-клітин.
Отримані результати вказують на особливості впливу препаратів імуноглобулінів на ріст і виживання Т-клітин лінії Jurkat, що може відображати індивідуальний стан гуморального імунітету донорів. Відмінності у дії препаратів Ig щодо клітин можуть бути пов’язані із присутністю в їхньому складі ауто-АТ певної антигенної специфічності і каталітичної активності. Особливої уваги заслуговує той факт, що досліджені препарати сумарних АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз і АТ молозива пророділь володіли як цитотоксичною, так і промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Ці дані вказують на те, що у молозиві людини можуть бути присутні ауто-АТ, які за своєю антигенною специфічністю і біологічною активністю подібні до ауто-АТ сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання.
Ауто-АТ молозива клінічно здорових породіль. Характерною ознакою аутоімунних порушень в організмі людини є поява високоспецифічних ауто-АТ до ядерних антигенів – дволанцюгової ДНК та гістонів. За допомогою ІЕА було проаналізовано 25 препаратів Igмолозива породіль на наявність у них анти-ДНК АТ та анти-гістонових АТ. Як позитивний контроль застосовували препарати IgGсироватки крові хворих на розсіяний склероз, а як негативний – препарати IgG сироватки крові здорових донорів. Встановлено, що вміст анти-ДНК АТ в усіх препаратах Ig молозива породіль, окрім препарату Ig№ 4, суттєво не відрізнявся від вмісту анти-ДНК АТ у препаратах IgG, виділених із сироватки крові здорових донорів (рис.5). Вміст анти-ДНК АТ у препараті № 4 був достовірно вищим, ніж в інших препаратах АТ, хоча у цілому, він був нижчим, ніж у препаратах IgG, виділених із сироватки крові хворих на розсіяний склероз.
Анти-гістонові АТ було виявлено у складі 12-ти препаратів Ig молозива породіль (Рис.5). При цьому у 6-ти препаратах їхній рівень був близьким або перевищував рівень анти-гістонових АТ, виявлених у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Найвищим вмістом анти-гістонових АТ характеризувався препарат № 4, де рівень анти-гістонових АТ у 2,5 разиперевищував їхній рівень у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз.
Додатковим підтвердженням наявності ауто-АТ у молозиві породіль можуть слугувати дані аналізу субклітинної локалізації антигенів секреторних імуноглобулінів А (sIgA) у фіксованих препаратах клітин. За допомогою FITC-мічених АТ, специфічних до IgA людини, було виявлено, що препарати сумарних імуноглобулінів молока містять sIgA-антитіла зі спорідненістю до антигенів Т-клітин лінії Jurkat. На Рис.6 представлено узагальнені результати
аналізу, які вказують, що за спорідненістю до антигенів клітин і місцем їхньої локалізації sIgA-антитіла можна розділити на три типи: ауто-АТ із високою спорідненістю до ядерних антигенів (ряд 1), ауто-АТ із низькою спорідненістю до антигенів клітин (ряд 2) і ауто-АТ із високою спорідненістю до компонентів цитоплазми і плазматичної мембрани цих клітин (ряд 3).
У цілому, аналіз отриманих даних свідчить про те, що у молозиві клінічно здорових породіль, як і у сироватці крові хворих на деякі аутоімунні захворювання, можуть бути присутні ауто-АТ. Це дозволяє припустити, що у молозиві жінок-породіль, подібно до сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання, можуть бути присутні ауто-АТ із цитотоксичною і промітогенною активністю щодо клітин ссавців. Для перевірки цього припущення із молозива породіль виділяли анти-ДНК sIgA і досліджували їхні функціональні властивості.
Характеристика функціональної активності анти-ДНК АТ молока породіль. Анти-ДНК sIgA виділяли хроматографією на ДНК-целюлозі (рис.7А) з електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, очищених із молока клінічно здорових породіль афінною та іонобмінною хроматографіями, як вказано на схемі, представленій на рис.1. Наявність sIgAу фракції білків, очищених на
ДНК-целюлозі було підтверджено Ds-Na-eлектрофорезом у градієнті ПААГ і імуноблотингом із використанням специфічних антитіл до IgA людини (рис.7Б).
Нуклеазна активність анти-ДНК sIgA молока людини. Характерною ознакою анти-ДНК АТ сироватки крові хворих на СЧВ (Shusteretal., 1990) і розсіяний склероз (Nevinskyetal., 2002) є їхня гідролізуюча активність щодо плазмідної ДНК. Під час аналізу нуклеазної активності анти-ДНК sIgA субстратами реакції слугували: рибосомна РНК клітин аденокарциноми лінії L929, надспіралізована і лінійна форми ДНК плазміди. Виявлено, що анти-ДНК sIgA, очищені із жіночого молозива, подібно до анти-ДНК АТ сироватки крові хворих на аутоімунні захворювання, володіють РНКазною, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю (рис.8). Нуклеазна активність анти-ДНК sIgA, отриманих із молока жінок у такий же спосіб, була незалежно від нас виявлена іншими дослідниками (Nevinsky, 2000).
На наступному етапі дослідження проведено пошук чинників, які можуть впливати на нуклеазну активність анти-ДНК sIgA. Встановлено, що 10 мкМ АТР суттєво інгібує гідроліз рРНК клітин аденокарциноми людини А549 і одноланцюгове розщеплення надспіралізованої форми ДНК плазміди. dATP у такій же концентрації не виявляв помітного впливу на РНКазну і топоізомеразну активність sIgA-абзимів. Іншу картину спостерігали при дослідженні впливу рибонуклеотидтрифосфатів (NTP) і дезоксирибонуклеотидтрифосфатів (dNTP) на ендонуклеазну активність анти-ДНК sIgA. На відміну від РНКазної і топоізомеразної активності, ендонуклеазна активність анти-ДНК sIgA-абзимів, крім АТР, повністю інгібувалася і dATP. При цьому GTP, CTP, TTP також суттєво інгібували реакцію гідролізу лінійної форми плазмідної ДНК. Часткове інгібування ендонуклеазної активності анти-ДНК sIgA молока людини спостерігалося у присутності dGTP, хоча dCTPdTTP не впливали на швидкість розщеплення ДНК плазміди.
Вибірковість дії нуклеотидтрифосфатів на РНКазну, топоізомеразну й ендонуклеазну активність sIgA-абзимів вказує на те, що в основу регуляції їхньої активності можуть бути задіяні, щонайменше, два незалежних механізми. За першим механізмом, регуляція нуклеазної активності може відбуватися шляхом фосфорилювання поліпептидів sIgAза участю sIgA-абзимів, які володіють протеїнкіназною активністю (Kitetal., 1991, 1995). Можливо, що фосфорилювання певних ділянок цих антитіл призводить до втрати їхньої спорідненості до нуклеїнових кислот, зокрема до рРНК. За другим механізмом, інгібування ендонуклеазної активності ДНК-гідролізуючих sIgA може відбуватися через зміну конформації каталітичного центру абзимів при зв’язуванні АТР і dATP із певними ділянками поліпептидів цих антитіл, задіяних в алостеричній регуляції їхньої нуклеазної активності.