Про можливе існування цих ділянок у sIgA-абзимів свідчать результати аналізу спорідненості щодо олігонуклеотидів і АТР електрофоретично гомогенних препаратів sIgA, отриманих із молока людини послідовними хроматографіями на протеїн А-сефарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.9). Очищені у такий спосіб sIgA слугували основою для подальшої очистки АТ, які володіють фосфотрансферазною і нуклеазною активністю.
За допомогою афінної модифікації sIgA-антитіл 32Р-міченими алкілуючими похідними олігонуклеотидів і АТР у присутності конкурентів (dT14 і АТР) встановлено, що секреторний компонент sIgAвиявляє спорідненість до дезоксирибоолігонуклеотидів (рис.9, доріжки 3, 4), тоді як важкі і легкі ланцюги цих антитіл, головним чином, зв’язуються із АТР (рис.9, доріжки 5, 6).
На основі цього аналізу було зроблено припущення про те, що подібно до інгібувальної дії АТР на нуклеазну активність sIgA-абзимів, олігонуклеотиди можуть бути залучені до регуляції протеїнкіназної активності sIgA-абзимів молозива породіль. Підтвердженням цього припущення слугувало дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активністю анти-ДНК sIgA молозива породіль.
Протеїнкіназна активність анти-ДНК sIgA молока людини. При інкубації sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, із [g-32P] ATP було виявлено включення радіоактивного фосфату у поліпептиди цих імуноглобулінів (рис.10А, доріжка 1), що свідчить про можливу протеїнкіназну активність анти-ДНК sIgA-антитіл. Незначний рівень протеїнкіназої активності цих АТ спостерігали, коли субстратом фосфорилювання слугував казеїн молока людини (рис.10Б, доріжка 6). Отримані результати показали, що подібно до sIgA-антитіл, очищених із молока людини хроматографією на АТР-сефарозі (Kitetal., 1996), анти-ДНК sIgA також можуть володіти протеїнкіназною активністю. У присутності мікромолярних кількостей дезоксирибоолігонуклеотиду d(A) 12 спостерігається значне зростання фосфорилювання важких ланцюгів sIgA (рис.10А, доріжки 5–8) і казеїну (рис.10Б, доріжки 1–5). При цьому рибоолігонуклеотид r(A) 12 помітно не впливав на протеїнкіназну активність цих антитіл (рис.10Б, доріжки 7–11). Таким чином, нами було з’ясовано, що sIgA, очищені із молока людини афінною хроматографією на ДНК-целюлозі, крім нуклеотид-залежної нуклеазної активності, також володіють олігонуклеотид-залежною протеїнкіназною активністю.
Цитотоксична активність анти-ДНК sIgA молока людини клітин ссавців invitro. Важливою властивістю анти-ДНК АТ, виділених із сироватки крові хворих на СЧВ і розсіяний склероз, є їхня здатність індукувати загибель клітин шляхом апоптозу (Kozyretal., 2000; Nevinskyetal., 2002). Подібну цитотоксичну активність також було виявлено в анти-ДНК IgG, очищених із молока клінічно здорових жінок (Nevinskyetal., 2002).
Аналіз спорідненості FITC-мічених sIgA, очищених на ДНК-целюлозі, виявив їхню здатність зв’язуватися із фіксованими Т-клітинами лінії Jurkat (рис.11). Розподіл флуоресцентної мітки показав, що мішенню дії анти-ДНК sIgA можуть бути структури, локалізовані на плазматичній мембрані, або в цитоплазмі цих клітин (рис.11, картинки 1, 3). Це дозволило припустити, що анти-ДНК sIgA можуть впливати на ріст і виживання клітин.
Ми вивчили дію препаратів анти-ДНК sIgA молозива породіль на життєздатність трансформованих фібробластів лінії L929 миші, клітин лейкемії людини (лінії Namalwa, Jurkat) та клітин лінії L1210 лейкемії миші. Вплив АТ на ріст і виживання клітин invitroвизначали за індексом життєздатності (ІЖ), який вираховували за формулою, наведеною у розділі “Матеріали і методи досліджень”. Аналіз отриманих даних свідчить про те, що використані нами лінії клітин суттєво відрізняються між собою за чутливістю до дії препаратів анти-ДНК sIgA(рис.12). Найбільш чутливими були фібробласти лінії L929 (ІЖ ≤ 20). Значно меншою цитотоксичною дією ці імуноглобуліни володіли щодо T-клітин ліній Jurkat (ІЖ ≥ 40) та В-клітин лінії L1210 (ІЖ ≥ 30). В-клітини лінії Namalwa були найменш чутливими до дії анти-ДНК sIgA (ІЖ ≥ 60).
На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що препарати sIgAзі спорідненістю до ДНК тимусу теляти, які містять абзими з нуклеазною і фосфотрансферазною активністю, можуть із різною ефективністю індукувати загибель ракових та трансформованих клітин invitro. Доведено, що цитотоксична дія анти-ДНК IgG сироватки крові хворих на системний червоний вовчак і на розсіяний склероз безпосередньо пов’язана із їхньою ДНКазною активністю АТ (Kozyretal., 2002). Тому можна припустити, що загибель клітин під дією анти-ДНК sIgA молозива людини відбувається за подібним механізмом.
Інший механізм біологічної дії каталітично активних sIgA молока людини може бути пов'язаний із особливістю транспортування секреторних АТ в організмі людини. В основі запропонованої моделі (рис.13) лежить механізм трансцитозу sIgA-антитіл через шар епітеліальних клітин слизових оболонок до секреторних рідин (жовч, слина, молоко і т.п.). Встановлено, що в процесі трансцитозу, sIgA-антитіла можуть бути залучені до внутрішньоклітинної нейтралізації вірусів (Lammetal., 1998; Masteskietal, 1997).
Базуючись на цих даних, можна припустити, що sIgA-абзими із нуклеазною активністю, здатні гідролізувати нуклеїнові кислоти вірусів у цитоплазмі епітеліоцитів і, таким чином, можуть бути задіяні у захисті епітеліальних клітин слизових оболонок людини від вірусних інфекцій. Наведені аргументи дозволяють припустити, що sIgA-абзими функціонують як фактори гуморального імунного захисту епітеліальних клітин від вірусних інфекцій.
Характеристика функціональної активності антигістонових антитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молока людини. Антитіла, каталітично активні щодо гідролізу гістону Н1, було вперше виявлено нами під час дослідження протеазної активності препаратів IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Основою для проведення таких досліджень слугували дані про те, що при цьому аутоімунному захворюванні у спинномозковій рідині і сироватці крові хворих можуть бути присутні абзими із гідролізуючою активністю щодо основного білка мієліну (ОБМ) [Polosukhinaetal., 2005; Gabibovetal., 2006]. Важливою особливістю білків цієї родини є їхній високий позитивний заряд (рI=12-13). Це дозволило нам припустити, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз присутні абзими, які здатні гідролізувати, крім ОБМ, також інші позитивно заряджені білки. Для перевірки цього припущення як субстрати протеолітично активних антитіл було використано лінкерний та корові гістони хроматину тимусу теляти і лізоцим курячого яйця. Аналіз протеолітичної активності 20-ти препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на розсіяний склероз хроматографією на протеїн А-сефарозі, виявив у зразках 3-х пацієнтів здатність каталізувати гідроліз гістону Н1. Аналіз 16-ти препаратів IgG сироватки крові здорових донорів не виявив у жодного з них гідролізуючої активності щодо цього білка. Дослідження протеолітичної активності 25-ти препаратів sIgA молозива породіль показало, що два з цих препаратів АТ виявляють гідролізуючу активність щодо гістону Н1.
На рис.14 наведено результати аналізу субстратної специфічності протеолітичної активності препаратів IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз (рис.14А) і sIgA молозива клінічно здорових породіль (рис.14Б).
Встановлено, що IgG - і sIgA-антитіла ефективно розщеплюють гістон Н1 (доріжки 2) і не гідролізують лізоцим курячого яйця (доріжки 6). У той же час препарати IgG і sIgAвідрізнялися між собою за здатністю гідролізувати корові гістони тимусу теляти. Із рис.14А видно, що у присутності IgG сироватки крові хворого на розсіяний склероз відбувається суттєве зменшення кількості деяких гістонів із паралельним зростанням вмісту низькомолекулярних продуктів їхнього гідролізу (доріжка 4). Присутність sIgA молозива у реакційному середовищі не впливала на рівень цих гістонів (рис.14. Б, доріжка 4), хоча певний приріст кількості низькомолекулярних поліпептидів на електрофоретичній доріжіці 4 вказує на те, що деякі із корових гістонів також можуть руйнуватися цими антитілами.
Щоб переконатися, що протеолітична активність препаратів імуноглобулінів дійсно належить АТ, а не домішкам ензимів, які можуть знаходитися у комплексі із АТ, каталітично активні препарати IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз і sIgA молозива породіль піддавали гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів (рН-шок-аналізу) (рис.15а). Виявлено, що гістон Н1-гідролізуюча активність хроматографічних фракцій каталітично активних препаратів IgG (рис.15А) і sIgA (рис.15Б) відповідає фракціям, які містять поліпептиди цих імуноглобулінів. Відсутність протеолітичної активності в інших хроматографічних фракціях свідчить про те, що гідроліз гістону Н1 відбувається саме за участю IgG і sIgA, а не під дією домішків протеаз сироватки крові чи молозива породіль у препаратах цих імуноглобулінів.
Присутність значного рівня антигістонових-АТ, виявлених нами у препаратах Ig молозива породіль і сироватки крові хворих на розсіяний склероз (рис.5), дозволяє припустити, що саме цим антитілам властива протеолітична активність щодо гістону Н1.
Для перевірки цієї гіпотези із каталітично активних препаратів IgG і sIgA хроматографією на гістон Н1-сефарозі виділили антигістонові антитіла (рис.16А) і проаналізували їхню протеолітичну активність. Електрофоретичний аналіз хроматографічних фракцій (рис.16Б) показав, що у складі препаратів IgG і sIgA присутні антитіла зі спорідненістю до гістону Н1 (антигістонові-АТ), які володіють гідролізуючою активністю щодо цього білка (рис.16В).
Отже, нами вперше встановлено, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз і в молозиві клінічно здорових породіль містяться абзими, здатні гідролізувати гістон Н1. Показано, що IgG - і sIgA-абзими різняться між собою за чутливістю до дії інгібіторів відомих протеаз.