Встановлено, що інкубація rsCD4 із плазмою крові людини призводить до фосфорилювання двох білків із мол. масою 62 і 12 кДа. Це вказує на те, що у плазмі крові можуть бути присутні ендогенні субстрати протеїнкіназної активності цього рецептора.
Отже нами встановлено, що рекомбінантний аналог білка, який належить до надродини імуноглобулінів, а саме рецептора Т-гелперних клітин СD4 володіє протеїнкіназною активністю.
Біологічна роль протеїнкіназної активності рецептора СD4 залишається невідомою. Оскільки у протеїнкіназній активності задіяний позаклітинний фрагмент рецептора, за місцем локалізації ензиму в клітині СD4 можна віднести до ектопротеїнкіназ плазматичної мембрани лімфоїдних клітин. Очевидно, протеїнкіназна активність рецептора CD4 може бути направлена як на регуляцію біологічної активності Т-гелперних лімфоцитів, так і на регуляцію взаємодії білків плазми крові і лімфи із Т-лімфоцитами і лімфоїдними клітини, які також продукують цей рецептор. Той факт, що присутність АТР є необхідною умовою активації Т-лімфоцитів (Filippinietal., 1990; Redegeltetal., 1991), може також слугувати на користь цього припущення.
У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне дослідження з метою виявлення, очистки та функціональної характеристики аутологічних антитіл сироватки крові та молока людини у нормі та при деяких аутоімунних захворюваннях. Отримані дані свідчать про те, що у сироватці крові і молоці людини присутні аутологічні антитіла із антигенною специфічністю щодо клітин ссавців, здатні каталізувати деякі біохімічні реакції. Встановлено, що ці антитіла впливають на ріст і виживання клітин invitro, причому деякі з них можуть зв’язуватися з клітинами та інтерналізуватися ними. У молозиві деяких клінічно здорових жінок-породіль присутні аутоантитіла, які за антигенною специфічністю, каталітичною активністю і за впливом на клітини ссавців подібні до аутоантитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і системний червоний вовчак. Це робить їх привабливими для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього використання як діагностичних та прогностичних маркерів аутоімунних порушень у породіль.
1. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль здатні індукувати апоптоз T-клітин лінії Jurkatабо стимулювати проліферацію цих клітин invitro. Значну цитотоксичну активність імуноглобулінів виявлено у 36% обстежених хворих на розсіяний склероз і 44% клінічно здорових породіль, тоді як промітогенну активність антитіл виявлено у 13,6% хворих на розсіяний склероз і 8% здорових породіль.
2. У молозиві 8% обстежених жінок-породіль встановлено підвищений рівень антитіл, які володіють спорідненістю до дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ), а у 48% породіль, виявлено антитіла зі спорідненістю до гістонів ссавців (анти-гістонові АТ).
3. Розроблено комплексний підхід для виділення та аналізу антигенної специфічності та каталітичної активності аутологічних антитіл сироватки крові і молока людини. Він полягає у використанні афінної та іонообмінної хроматографії, а також гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів, і дозволяє отримати високоочищені препарати аутоантитіл певної каталітичної активності.
4. Анти-ДНК sIgA молока людини володіють рибонуклеазою активністю щодо рибосомної РНК, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю щодо надспіралізованої і лінійної форм ДНК плазміди, а також протеїнкіназною активністю щодо власних поліпептидів і казеїну молока людини. АТР і dАТР інгібують нуклеазну активність цих sIgA-абзимів, а синтетичні дезоксирибоолігонуклеотиди стимулють протеїнкіназну активність цих антитіл.
5. Анти-ДНК sIgAмолозива породіль із різною ефективністю індукують загибель імунокомпетентних клітин (лінії Namalwa, Jurkat і L1210), а також трансформованих фібробластів миші (лінія L929). За чутливістю до цитотоксичної дії цих антитіл, досліджувані лінії клітин розподіляються наступним чином: L929 > Jurkat> L1210 > Namalwa.
6. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак уперше виявлено антитіла класів sIgA і IgG, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються з цими антитілами під час їхньої очистки на протеїн А-сефарозі, ДЕАЕ-фрактогелі, АТР-сефарозі і фосфорилюються у складі імунних комплексів у присутності [g-32P] ATP. Гель-фільтрація даних антитіл у буфері, який містить 5% діоксан, призводить до дисоціації імунних комплексів і стимуляції протеїнкіназної активності антитіл.
7. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз вперше виявлено анти-гістонові sIgA - і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз гістону Н1. Анти-гістонові антитіла обох ізотипів гідролізують корові гістони із значно нижчою ефективністю, ніж лінкерний гістон Н1, і не гідролізують альбумін сироватки крові бика і лізоцим курячого яйця.
8. Анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз стимулюють проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat. Приріст кількості цих клітин порівняно з контролем складав 37% при дії 70 мкг/мл антитіл упродовж 72 год. У той же час, анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль не впливають на проліферацію Т-клітин лінії Jurkat.
9. Анти-гістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз зв’язуються з Т-клітинами ліній Jurkat і L929, які здатні їх інтерналізувати. Взаємодія цих аутоантитіл із Т-клітинами лінії Jurkatупродовж 2 год або з клітинами лінії L929 упродовж 6 і 24 год призводить до значного їх накопичення у цитоплазмі клітин-мішеней. За таких умов анти-гістонові sIgA-антитіл молозива жінок-породіль не інтерналізуються клітинами вказаних ліній.
1. Кит Ю.Я. Фосфорилирование рецептора rsCD4 в присутствии клеток и плазмы крови человека / Ю.Я. Кит, В.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1995. - Т.340, № 3. - С.412-415. (Автором визначено завдання досліджень, проведено фосфорилювання rsCD4 за участю протеїнкіназ і підготовлено статтю до друку)
2. Kit Y. Y. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobylin A / Y. Y. Kit, D. V. Semenov, G. A. Nevinsky // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. - V.36, No 3. - P.521-527. (Автором проведено виділення й аналіз протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
3. Кит Ю.Я. В препаратах человеческого α-лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды / Ю.Я. Кит, Е.В. Кулигина., И.В. Романникова, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1998. - Т.360, № 3. - С.406-408. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз досліджень і підготовлено статтю до друку).
4. Кит Ю.Я. Фосфорилирование липидов, прочно связанных с иммуноглобулином А, в препаратах антител из молока человека, обладающих протеинкиназной активностью / Ю.Я. Кит, М.В. Шипицин, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 6. - С.852-858. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз ліпідкіназної активності sIgA молозива породіль).
5. Yakubov L. A. The extracellular domain of CD4 receptor possesses a protein kinase activity / L. A. Yakubov, Y. Y. Kit, V. A. Richter, A. Y. Andreeva, V. N. Karamyshev, C. A. Stein, V. V. Vlassov // FEBS Lett. - 1998. - V.431, No 1. - P.45-48. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності rsCD4).
6. Семенов Д.В. Иммуноглобулин G молока человека гидролизует нуклеотиды / Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Ю.Я. Кит, Д.Ю. Хлиманков, А.М. Акимжанов, Д.А. Горбунов, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 8. - С.1097-1106. (За участю автора сплановано мету досліджень і проаналізовано отримані результати).
7. Nevinsky G. A. Secretory Immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein рhosphorylation / G. A. Nevinsky, Y. Ya. Kit, D. V. Semenov, D. Y. Khlimankov, V. N. Buneva // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1998. - V.75, No 1. - P.77-91. (За участю автора сплановано завдання досліджень, проведено аналіз субстратної специфічності протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
8. Кит Ю.Я. Секреторные иммуноглобулины А молока человека обладают сродством к олигонуклеотидам и нуклеиновым кислотам / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Е.В. Кулигина, И.В. Романникова, О.В. Морозова, В.А. Рихтер // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 1. - С.52-59. (Автором сформульовано завдання досліджень, проведено виділення АТ, підготовлено статтю до друку).
9. Кит Ю.Я. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность / Ю.Я. Кит, Е. В Кулигина, А.М. Онищенко, Л.В. Юрченко, И.В. Романникова, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 8. - С.59-64. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності білків молозива породіль, підготовлено статтю до друку).
10. Кулигина Е.В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спинномозговой жидкости человека / Е.В. Кулигина, А.Ю. Андреева, А.С. Могельницкий, Ю.Я. Кит, Л.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1999. - Т.364, № 6. - С.832-834. (Автором розроблено схему виділення олігонуклеотидів із спинномозкової рідини людини, проведено аналіз олігонуклеотид-звязувальних білків, підготовлено статтю до друку).