Кит Ю.Я. Антитела молока и сыворотки крови человека: характеристика каталитической активности и влияние на рост и выживание клеток. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. – Інститут биологии клетки НАН Украины, Львов, 2008.
Диссертация посвящена исследованию антигенной специфичности, каталитической активности антител сыворотки крови и молозива человека в норме и при некоторых аутоимунных заболеваниях, а также изучению влияния антител на рост и выживание клеток млекопитающих.
Установлено, что препараты иммуноглобулинов сыворотки крови некоторых больных рассеяным склерозом и молозива здоровых рожениц могут индуцировать гибель или стимулировать пролиферацию различных клеток-мишеней in vitro. Анализом нуклеосомной фрагментации ядерной ДНК и ДНК-комет индивидуальных клеток показано, что гибель клеток под действием иммуноглобулинов происходит путем апоптоза. Функциональная активность препаратов иммуноглобулинов относительно клеток млекопитающих могла быть следствием действия аутоантител определеной антигенной специфичности и каталитической активности. Иммуноферментным анализом установлено, что препараты антител двух из 25-ти обследованных рожениц содержат повышенный уровень анти-ДНК антител, а у 12-ти рожениц обнаружено повышенный уровень антигистоновых антител.
Используя афинную и ионообменную хроматографии, из сыворотки крови и молока человека очищены аутоантитела разных изотипов и проведен анализ их каталитической активности, а также влияния на рост и выживание клеток in vitro.
Установлено, что анти-ДНК sIgA молозива обладают РНКазной, ДНКазной и протеинкиназной активностью. АТР и dАТР ингибируют нуклеазную активность sIgA-абзимов, а дезоксирибоолигонуклеотиды стимулируют протеинкиназную активность этих антител.
Обнаружено, что анти-ДНК sIgA с разной эффективностью индуцируют гибель иммунокомпетентных клеток линий Namalwa, Jurkatи L1210 и фибробластов мыши линии L929.
На основании полученных результатов и анализа литературных данных предложена модель участия sIgA-абзимов во внутриклеточной нейтрализации вирусов в инфицированных эпителиоцитах слизистых оболочек.
Из молока клинически здоровых рожениц и из сыворотки крови больных рассеянным склерозом очищены антигистоновые sIgA - и IgG-антитела, обладающие способностью гидролизовать линкерный гистон Н1. Антигистоновые АТ обоих изотипов с более низкой эффективностью, чем гистон Н1, гидролизовали коровые гистоны, но были неактивны по отношению к лизоциму куриного яйца и сывороточного альбумина быка.
Установлено, что анти-гистоновые IgG сыворотки крови больных рассеянным склерозом могут стимулировать пролиферацию Т-клеток линии Jurkat. Прирост количества клеток составлял 37% при действии 70 мкг/мл антител на протяжении 72 ч. В то же время, анти-гистоновые sIgA молозива не влияли на пролиферацию Т-клеток линии Jurkat.
Обнаружено, что анти-гистоновые IgG сыворотки крови больных рассеянным склерозом могут проникать в клетки линий Jurkat и L929. Инкубация антител в течении 2 ч с клетками линии Jurkat и в течении 6 и 24 ч с клетками линии L929 приводила к значительному их накапливанию в цитоплазме клеток-мишеней. При таких же условиях инкубации не обнаружено интернализации анти-гистоновых sIgA-антител в клетки-мишени.
На основании полученных результатов предложен механизм промитогенной активности анти-гистоновых IgG-антител.
Из молока рожениц и сыворотки крови больных системной красной волчанкой очищены sIgA - и IgG-антитела со сродством к АТР-сефарозе, обладающих липидкиназной и протеинкиназной активностью. Субстраты липидкиназной активности выделяются совместно с антителами в процессе их очистки на протеин А-сефарозе, ДЕАЕ-фрактогеле, АТР-сефарозе и фосфорилируются в составе комплексов в присутствии [g-32P] ATP. Наличие 32Р-меченных липидов в препаратах антител подтверджено хлороформ-метанольной экстракцией и ТСХ. Гель-фильтрация в присутствии 5% диоксана приводит к дисоциации комплексов липидов с антителами и стимуляции фосфорилирования их полипептидов.
Установлено, что протеинкиназной активностью помимо иммуноглобулинов может обладать также другой белок этого семейства - рецептор Т-хелперных клеток CD4. Инкубация рекомбинантного рецептора rsCD4 («Genintech», США) с [g-32P] ATP в присутствии ионов Са2+ приводит к его фосфорилированию. В присутствии ионов Mg2+ rsCD4 обладает способностью к фосфорилированию казеина коровьего молока и некоторых белков плазмы крови человека.
Ключевые слова: антитела, каталитическая активность, цитотоксичность, пролиферация, молозиво, сыворотка крови, рассеянный склероз.
Kit Yu. Ya. Antibodies of human milk and serum: characteristics of catalytic activity and action towards cell growth and survival. – Manuscript.
Thesis for the Doctor of Biological Sciences scientific degree in biology, speciality 03.00.11 – cytology, cell biology, histology. – Institute of Cell Biology of NAS of Ukraine, Lviv, 79005.
The Doctoral thesis is focused on the study of antigen specificity and catalytic activity of human serum and milk antibodies in healthy people and during some autoimmune pathologies, and also towards estimation of the antibodies’ influence on growth and survival of the mammalian cells.
It has been shown that different preparations of immunoglobulins, obtained from collostrum of healthy woman and blood serum of some patients with multiple sclerosis can induce cells death in vitro or, in contrary, stimulate proliferation of the studied target cells. Functional activity of antibodies against cells could be linked with their antigen specificity and catalytic activity.
Anti-DNA sIgA, isolated from human colostrum possesses topoisomerase, ribonuclease, endonuclease and proteinkinase activities. ATP and dATP inhibit nuclease activities of anti-DNA sIgA, while oligodeoxinucleotides stimulate their activity. Anti-DNA sIgA isolated from human colostrum possessed different extent of cytotoxic activity towards Namalwa, Jurkat, L1210 and L929 cell lines.
We found anti-histone sIgA - and IgG-antibodies capable of catalyzing hydrolysis of linker histone H1 in the colostrums of healthy woman and blood serum of some patients with multiple sclerosis. Anti-histone IgG from blood serum of patients with multiple sclerosis were able to internalize into Jurkat and L929 cells and also to stimulate proliferation of Jurkat human T-cell line.
We also detected sIgA - and IgG-antibodies possessing lipid kinase and protein kinase activity in the collostrum of healthy woman and blood serum of some patients with system lupus erythrematosis. Lipids were co-purified with antibodies during their purification and were phosphorylated in those complexes in the presence of [g-32P] ATP. Gel-filtration in dioxan containing buffer (5%) lead to dissociation of lipid-antibodies complexes and stimulation of protein kinase activity of immunoglobulins.
Keywords: antibodies, catalytic activity, cytotoxicity, proliferation, colostrum, blood serum, multiple sclerosis.