Практичне значення одержаних результатів. Установлені ефекти можуть бути використані під час розробки тест-систем для виявлення станів інтоксикації організму сполуками свинцю та створення схем корекції порушень у клітинному метаболізмі, зумовлених катіонами важкого металу, а також у курсах лекцій з біохімії та фізіології людини і тварин.
Особистий внесок здобувача. Відповідно до мети і завдань дисертаційної роботи автор особисто виконала експериментальні дослідження, статистично опрацювала результати, проаналізувала наукову літературу за темою дисертації, сформулювала основні висновки роботи. Аналіз одержаних результатів та підготовку до друку публікацій за матеріалами дисертації здійснено разом з науковим керівником, доктором біологічних наук професором З.Д. Воробцем. Ряд розділів роботи обговорено з доктором біологічних наук, професором Г.Л. Антоняк. Окремі експериментальні дослідження виконано за участю співавторів публікацій.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на науково-практичній конференції “Досягнення молодих вчених у вирішенні проблем тваринництва та ветеринарної медицини” (Львів, 2004 р.), на ювілейній 67-й підсумковій науковій конференції СНТ ім. М.Д.Довгялло, присвяченій 75-річчю ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 2005 р.), 48-й підсумковій науково-практичній конференції “Здобутки клінічної та експериментальної медицини” Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (Тернопіль, 2005р.), 9-муУкраїнському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.), Міжнародній науковій конференції ”Механізми функціонування фізіологічних систем” (Львів, 2006 р.).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 10 наукових публікаціях (з них 5 статей опубліковано в наукових фахових виданнях та 5 тез доповідей – у матеріалах конференцій).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень та їх аналізу, висновків і списку використаних джерел із 337 найменувань. Робота викладена на 136 сторінках, містить 17 таблиць і 9 рисунків, які складають 14 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Висвітлено шляхи надходження, транспорту, нагромадження, перерозподілу та виведення сполук свинцю з організму тварин. Показано вплив даного важкого металу на функціонування органів і систем організму, механізми впливу на деякі процеси метаболізму (антиоксидантну систему, перебіг процесів пероксидного окиснення ліпідів, еритро- і лімфопоезу).
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на 120 безпородних білих щурах масою 150–180 г, яких утримували в умовах віварію.
Ацетат свинцю вводили тваринам одноразовою внутрішньочеревинною ін’єкцією у дозі 10 мг Pb/кг маси тварин. При виборі дози користувались даними літератури (HaradaK., MiuraH., 1983; ItoY.etal. 1985; VargasН. etal., 2003).
Вітамін Е (α-токоферолу ацетат) дозою 300 мг/кг маси вводили тваринам перорально щодоби впродовж трьох діб після введення ацетату свинцю. Для досліджень використовували тварин на 3-тю і 10-ту доби експерименту.
Матеріалом досліджень була змішана периферична кров, яку отримували після декапітації тварин дослідних і контрольної груп.
Кількість клітин крові (еритроцити і лейкоцити) досліджували за допомогою підрахунку в камері Горяєва, відносний вміст паличкоядерних і поліморфоядерних нейтрофільних гранулоцитів і лімфоцитів визначали цитологічними дослідженнями мазків крові (Неменова Ю.М., 1976). Відносний вміст популяцій еритроцитів крові (молоді, зрілі й старі клітини) визначали фракціонуванням у градієнті густини сахарози (Сизова И.А.и др., 1985).
Для отримання еритроцитів гепаринізовану кров центрифугували на рефрижераторній центрифузі. Плазму відбирали, а клітини тричі промивали фізіологічним розчином(0,85%NaCl)з подальшим центрифугуванням (Неменова Ю.М., 1976).Лімфоцити з гепаринізованої крові виділяли методом диференціального центрифугування в градієнті густини фіколу і верографіну (Boyum А.А., 1968; Mishell В.В., ShiigiS.M., 1980).
Концентрацію гемоглобіну в гемолізатах визначали вціанметформі при 540нм за методом Драбкіна (DrabkinD.,AustinH., 1935). Спорідненість гемоглобіну до кисню визначали спектрофотометричним методом побудови кривих кисневої рівноваги гемоглобіну, який ґрунтується на відмінностях у спектрах поглинання оксигенованого і деоксигенованого гемоглобіну (Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И., 1987; Столяр О.Б. та ін., 1984).
Концентрацію лактату визначали в позбавленому білків екстракті клітин за допомогою ферментного методу (ChapmanR.G.etal., 1962), аналізували загальну концентрацію 2,3-дифосфогліцерату (2,3-DPG) в еритроцитах методом (DyceB.J., BessmanS., 1973).
У лізатах клітин (еритроцити, лімфоцити) визначали активність ферментів енергетичного обміну: піруваткінази (BergmeyerH.U., BerntE., 1974), лактатдегідрогенази (ChapmanR.G.etal., 1962), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (DeutschJ., 1983). Крім цього, в лізатах лімфоцитів визначали NADP-залежну ізоцитратдегідрогеназну активність (GoldbergD.M., EllisG., 1983). Активність ферментів визначали за допомогою спектрофотометричних методів, що ґрунтуються на використанні систем окиснення й відновлення нікотинамідних коферментів (BergmeyerH.U., GrasslM., 1983). Вміст білка в лізатах визначали методом Лоурі (LowryO.H. etal., 1951).
У лізатах клітин визначали активнiсть ферментів антиоксидантної системи: супероксиддисмутази (Дубинина Е.Е. и др., 1983), глутатіонпероксидази (Моин В.М., 1986) і глутатіонредуктази (BergmeyerH.U., Grassl М., 1983), а також концентрацію продуктів пероксидного окиснення ліпідів: малонового діальдегіду (Коробейникова Е.Н., 1989) і гідропероксидів ліпідів (Орехович В.Н., 1977).
Статистичну обробкурезультатів здійснювали в режимі програмного забезпечення на персональному комп’ютері ІВМ РСіз використаннямкритерію Стьюдента (Кокунин В.А, 1975).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Для дослідження ефектів катіонів Pb2+ на процес гемопоезу досліджено вплив ацетату свинцю за умов його одноразового парентерального введення дозою 10 мг/кг маси на кількісний вміст клітин крові (еритроцити, лейкоцити), відносний вміст їх популяцій, гематокритне число та інші показники динаміки процесів кровотворення у білих лабораторних щурів (Кудрявцев А.А. и др., 1969; StankiewychW., 1973; Козловская Л.В., Николаев А.Ю., 1984; Сибірна Н.О., Великий М.М., 1997).Вплив іонів свинцю на динаміку еритроцитів у периферичній крові щурів
Введення ацетату свинцю експериментальним тваринам зумовлює істотні зміни показників стану кровотворення, які виявляються і щодо еритропоезу, і щодо лейкопоезу. З’ясовано, що впродовж 10 діб експерименту в крові щурів зменшується загальна кількість еритроцитів, показник гематокриту (p<0,05), але об’єм еритроцитів у цей період досліджень залишається стабільним.
Як відомо, склад еритроїдних клітин у крові тварин неоднорідний, у кровообігу одночасно функціонують молоді, зрілі й старі еритроцити, які відрізняються функціональними характеристиками (Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И., 1987; ShermanI.W. etal., 2004). Результати досліджень динаміки популяцій еритроцитів у крові щурів, яким вводили ацетат свинцю, свідчать, що характерним є зменшення вмісту фракції молодих клітин у крові тварин 3-ї дослідної групи, аналізованих на 10-ту добу після введення токсиканта (p<0,05).
Це може свідчити про пригнічення еритропоезу на стадіях проліферації або дозрівання еритробластів у кістковому мозку. Аналізуючи результати, слід враховувати можливий інгібуючий вплив катіонів свинцю на процеси синтезу безпосередніх регуляторів процесів еритропоезу в кістковому мозку, передусім, еритропоетину (RomeoR.etal., 1996; Jaureguy М., ChoukrounG., 2006; KwackC., BalakrishnanV.S., 2006). Водночас вміст молодих еритроцитів у крові інтоксикованих ацетатом свинцю щурів може зменшуватитись прискоренням процесів дозрівання еритроїдних клітин у кровообігу (Першин О.І., 2004; Першин О.І., Воробець З.Д., 2005).
Відносний вміст старих еритроцитів у крові щурів істотно збільшується через одну добу після введення ацетату свинцю. Збільшення вмісту старих еритроцитів вказує на погіршення кисень-транспортної функції крові тварин під впливом катіонів Pb2+. Це зумовлюється тим, що в старих клітинах знижується активність ферментів гліколізу, вміст АТР і 2,3-дифосфогліцерату. У таких клітинах зростає інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів, що зумовлює руйнівні процеси в плазматичних мембранах і порушення їхніх функцій (StraussR.G., MaurerA.M., 1978; ShermanI.W. etal., 2004). Тому старі еритроцити характеризуються меншою здатністю до транспорту кисню, ніж молоді та зрілі у функціональному відношенні клітини.
Вплив іонів свинцю на динаміку лейкоцитів і їх популяцій у периферичній крові щурів
Результати досліджень вмісту лейкоцитів у крові щурів дослідних груп свідчать про те, що введення ацетату свинцю не зумовлює вірогідних змін у загальній кількості цих клітин порівняно з контролем упродовж всього експерименту. Однак у зазначений період досліджень виявлено істотне збільшення вмісту популяції дозріваючих клітин гранулоцитопоезу – паличкоядерних нейтрофільних гранулоцитів за стабільного відносного вмісту сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів (p<0,05).
За таких умов співвідношення між вмістом молодих і зрілих нейтрофільних гранулоцитів у крові щурів дослідних груп в усі терміни експерименту досягає більших значень, ніж у крові тварин контрольної групи. Зокрема, значне збільшення цього співвідношення (на 52,2%) виявляється на 3-тю добу після введення тваринам ацетату свинцю.
Вплив катіонів свинцю на функціональні властивості гемоглобіну в еритроцитах тварин
З’ясовано, що, починаючи з першої доби після ін’єкції ацетату свинцю, у тварин дослідних груп виявляється тенденція до зменшення концентрації гемоглобіну в крові. У дальшому періоді експерименту (у тварин групи Д3) виявлено вірогідне зменшення цього показника (p<0,05). Це супроводжується зменшенням вмісту гемоглобіну в еритроцитах (у середньому на 27 % у щурів групи Д3), що свідчить про зменшення кисневої ємності крові піддослідних тварин.