К преимуществам ДНК-вакцин, кроме уже упоминавшейся простоты их получения, производства и хранения, можно отнести и то, что при введении в организм они как бы имитируют нахождение в нем настоящего патогена, поскольку образование белковых продуктов, выступающих антигенами, происходит в этом случае непосредственно в клетках человека или животного и, следовательно, все посттрансляционные модификации белков происходят в полном соответствии тому, как это совершается при настоящей инфекции. Видимо, этим можно объяснить и высокий уровень иммунного ответа на ДНК-вакцины, и их специфичность.
Особенности иммунного ответа. Механизмы иммунного ответа на введение ДНК-вакцин, не исследованы. При иммунизации убитыми (химическими, субъединичными) вакцинами экзогенные антигены разрушаются до пептидов внутри эндосомных компартментов клетки. Далее они появляются на поверхности этих клеток в соединении с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (МНС-И). Их распознавание СД4 + Т-хэлперными лимфоцитами (Th) побуждает последних к секреции растворимых факторов (цитокинов), регулирующих эффекторные механизмы гуморального иммунного ответа.
Эффективность иммунизации. J.J. Donnelly et al. (1995) наблюдали перекрестно-штаммовый (видоспецифический) иммунитет в отношении возбудителей гриппа. Самок мышей линии BALB/c в 4-, 7- и 10-недельном возрасте иммунизировали 100 мкг плазмидной ДНК с геном нуклеопротеина (NP), клонированным из генома вируса гриппа A/PR/8/34(H 1N1) (рис. 1, А, синие кружки). Мышам контрольной группы вводили по этой же схеме векторную плазмиду без клонированного гена (светлые кружки). В 13-недельном возрасте грызунов инфицировали интраназально 200 LD50вируса А/НК/68 (H3N2). Мышей другой экспериментальной группы вакцинировали по такой же схеме очищенным NP, а контрольной — не иммунизировали. Животных инфицировали интраназально 200 LD50 вируса А/НК/68 (H3N2).
Защитный эффект при иммунизации ДНК-вакциной составлял 100%, а при использовании химической вакцины на основе этого же антигена он отсутствовал.
Интересную конструкцию плазмидного вектора для иммунизации животных против вируса клещевого энцефалита разработали Е.Э. Митрофанов и соавт. (1997). Вектор включает ген гликопротеина оболочки вириона и ген неструктурного гликопротеина NS1, который находится на поверхности инфицированных вирусом клещевого энцефалита (ВЭК) клеток. Защитный эффект ДНК-иммунизации исследовали на мышах линии BALB/c. Животных 5-кратно иммунизировали 80–100 мкг вектора pSVK3-ENS1 и через неделю после последней прививки инфицировали 100 LD50 ВЭК (штамм Софьин). В контрольной группе заболели все мыши и 43% из них погибли. Животные, иммунизированные ДНК-вакциной, оставались здоровыми в течение всего срока наблюдения.
При изучении длительности иммунного ответа Н.L. Davis обнаружили, что после ДНК-иммунизации мышей геном поверхностного антигена вируса гепатита В уровень антител выходит на плато на 104 сут и остается стабильным 18 мес. Бустерная иммунизация через 7 мес увеличивала количество антител более чем в 10 раз. Теоретически с помощью ДНК-вакцины при однократном ее введении можно достичь пожизненной резистентности иммунизированных особей к одному или нескольким возбудителям инфекционных болезней.
Массовая иммунизация. Некоторые авторы говорят о дешевизне ДНК-вакцин, однако исследователи, которые сами выделяли плазмидную ДНК, хорошо представляют, что получение в лабораторных условиях 100 мкг плазмид для иммунизации только одной мыши — процесс трудоемкий. Тем более что в любом препарате ковалентно замкнутая кольцевая (кзк) плазмида при хранении постепенно образует открыто кольцевые и линейные формы, трансфецирующая активность которых в 100 и более раз ниже, чем у кзк форм ДНК плазмид. Поэтому ДНК-вакцина, предназначенная для иммунизации животных в условиях хозяйств, должна быть разработана для внутрикожной инъекции, то есть представлять собой композицию, состоящую из мельчайших твердых частиц с сорбированными на них плазмидными ДНК. Внутрикожное введение ДНК-вакцины целесообразно осуществлять сжатым воздухом с помощью специального точно дозирующего аппарата. Альтернативным способом введения ДНК-вакцин могут быть саморазрушающиеся бактериальные векторы, применяемые перорально.
Новые инфекции. ДНК-вакцины могут стать важным элементом мероприятий, направленных на ликвидацию вспышек новых инфекций среди сельскохозяйственных животных. Клонирование в плазмидный вектор с помощью ПЦР гена полноразмерного оболочечного гликопротеина вируса требует не более недели, после этого ДНК-вакцина готова для применения в очаге эпизоотии. В экстренном случае, при неизвестности гена протективного антигена, можно использовать экспрессионную библиотеку генов. Целесообразно заранее подготовить плазмиды, экспрессирующие гены протективных белков возбудителей африканской чумы свиней, везикулярного стоматита крупного рогатого скота, чумы рогатого скота, ящура и некоторых других.
Преимущества ДНК-иммунизации перед распространенными способами иммунопрофилактики массовых инфекционных болезней животных заключаются в том, что ДНК-вакцины без персистирования в макроорганизме приближают искусственно вызываемый иммунный ответ к возможному при инфицировании природными возбудителями; иммунная реакция на введение генов антигенов сбалансирована и состоит из системного и местного ответов. Каждый из них включает иммуноглобулиновый и клеточный ответы. Иммунный ответ такого типа важен для противодействия инфекциям, вызываемым вирусами и грамотрицательными микроорганизмами.
За последние 10 лет в вакцинологии сформировалось новое направление, который основан на принципе, когда в организм вводится не белок, но нуклеиновая кислота (ДНК либо РНК). Это направление называют «генетической иммунизацией», «вакцинацией нуклеиновыми кислотами», «ДНК-вакцинацией» и связывают с данным направлением революционные изменения в вакцинологии ближайшего будущего. Несмотря на то, что способность ДНК и РНК инициировать синтез кодируемых ими белков после проникновения в клетку известна давно, только в середине 90-х годов предыдущего сотни лет были осознаны и сформулированы возможности данной технологии сообразно к медицине, ветеринарии и фундаментальной науке. Этот новый подход довольно прост, дешев и главнейшее дает возможность унифицировать методические подходы. За разработки относительно безопасных векторных систем, повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот в ткани, обнаружения возможности длительной (до влага) экспрессии чужеродной ДНК в трансформированных клетках in vivo стал ясен потенциал данной технологии в генотерапии и создании вакцинных препаратов. В 1993г. было показано, что ДНК-вакцинация приводит к полноценному иммунному ответу, то есть к образованию антител (гуморальный реакция) и цитотоксических Т-лимфоцитов (клеточный реакция), обеспечивает у животных высокий порядок защиты от вирусной инфекции.
Интерес к ДНК-вакцинам стимулирует строй перспективных свойств, которыми они обладают.
Используя один и тот же вирусный или плазмидный вектор, можно создавать вакцины, против разных инфекционных заболеваний, меняя только последовательность, которая кодирует необходимые антигены. При данном отпадает нужда манипулирования с патогенными вирусами и бактериями. Отпадает дорогостоящая и сложная действие очистки антигенов. Важно то, что препараты ДНК-вакцин не требуют специальных методов доставки и стабильны длительное время при комнатной температуре.
ДНК-вакцины содержат структуры, распознаваемые системой врожденного иммунитета как чужие (CpG олигонуклеотиды бактериальной нуклеиновой кислоты). Поэтому от них ожидают высокую иммунологическую эффективность.
В время разработаны и испытываются ДНК-вакцины против инфекций вызываемых вирусами гепатитов В и С, вирусом гриппа, вирусом лимфоцитарного хориоменингита, вирусом бешенства, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом японского энцефалита и возбудителями сальмонеллеза, туберкулеза и некоторых паразитарных заболеваний (лейшманиоз, малярия). Выбор инфекций связан не только с их высокой актуальностью для человечества, но и с безуспешными попытками сотворить надежные вакцинные препараты классическими, широко используемыми сейчас методами. ДНК-вакцинация представляется одним с перспективнейших направлений в борьбе с раком.
Литература
1. Вакцинопрофилактика под ред. В.К. Таточенко, Н.А. Озерецковского) / М., 1994
2. Супотницкий М.В. // Ветеринария. 1996
3. Вишняков И.Ф. и др. // Ветеринария. 1998