Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією ГМК кишечнику морської свинки. Активація пуринорецепторів мембрани інтестинальних ГМК аплікацією АТФ, доданого до зовнішнього розчину, активує КCa канали. Ми вивчали ефекти наведеного агоніста на струм при підтримуваному потенціалі − 40 мВ.
За таких умов АТФ в концентрації 100 мкM істотно підвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплітуди. Приріст СВС малої амплітуди на максимумі складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).
У більшості ГМК локальне спонтанне вивільнення кальцію (спарки) обумовлено активністю ріанодинових депо, оскільки аплікація ріанодину викликає блокування спонтанного та підсиленого агоністами вивільнення іонів Са2+ (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З іншого боку показано, що виділення кальцію з інозитолтрифосфат (ІР3) - керованого депо є як джерелом активності Са2+ “puffs” в гладеньких м`язах, так і регенеративної взаємодії між виділенням кальцію з ІР3 рецепторів та ріанодинових рецепторів (Boittin et al., 2000). Зазвичай, підсилення продукції ІР3 та наступне виділення Са2+ є характерною рисою для відповіді на аплікацію гальмуючих агоністів в гладеньких м`язах. У випадку гладеньких м`язів ШКТ, цей механізм може пояснити пригнічувальну дію АТФ, який вважається гальмівним нейротрансміттером, виділеним з ентеро-мотонейронів (Shuba et al. 2003).
Преінкубація клітин в розчині, що містив 30 мкМ 2-АРВ, блокатора ІР3 рецепторів, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 мкМ) не призводить до суттєвих змін у частоті появи викликаних СВС, як малої так і великої амплітуди (рис. 10). Окрім цього, інкубація в розчині 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплітуди (дані не наведено), що може свідчити про залежність цієї частини СВС від кальцію, що звільняється з ІР3 чутливого депо. До того ж можна припустити, що активація ІР3 залежного депо виступає пусковим механізмом в ефекті активації гальмування, викликаного АТФ.
Для блокування ІР3 шляху застосовували блокатор фосфоліпази С (U73122). За таких умов не відбувалось збільшення частоти СВС при аплікації АТФ. (Рис. 11). Відсутність збільшення частоти СВС у відповідь на аплікацію АТФ на фоні U73122 до зовнішнього розчину свідчить, що ІР3 залежне збільшення вивільнення кальцію − основний механізм P2Y рецептор-модульованої стимуляції вихідного струму та гіперполяризації. Вивільнення кальцію асоційоване з активацією SK та BK каналів міоцитів taenia caeci.
На рис. 12 подано вплив блокаторів КСа каналів на викликані агоністіндукованою активацією СВС. Потенціал фіксації становив – 40 мВ. Як видно d-ТК, як антагоніст SK каналів, в концентрації 50 мкМ послаблював СВС малої амплітуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрації (n= 5). СВС великої амплітуди були також дещо пригнічені застосуванням d-ТК. Це вказує на наявність в складі викликаних СВС великої амплітуди компоненти струму d-ТКчутливих каналів. Результати свідчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, є результатом відкривань BK каналів та d-ТКчутливих каналів. Аплікація ТЕА (1 мМ), як неселективного блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК блокувала не лише СВС великої амплітуди, але і залишкові СВС малої амплітуди. На рис. 12 Б. наведено амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС, індуковані аплікацією АТФ. Пригнічення SK каналів може призводити до редукції СВС великої амплітуди та сприйняття останніх в якості СВС малої амплітуди після застосування d-ТК.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
В результаті проведених досліджень по розділенню сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього м’яза сліпої кишки (taenia саесі) морської свинки на компоненти, дослідженню їх фармако-біофізичних характеристик було показано, що при ступінчастій деполяризації мембрани в переносі вихідного струму приймають участь потенціалкеровані К+ канали затриманого випрямлення та два типи КСа каналів, що узгоджується з літературними даними (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявність паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК, та паксиліннечутливого компоненту. Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), які переносяться через КСа великої провідності, ефективно блокуються наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСа каналів великої провідності не призводив до блокування вихідних струмів, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фоні дії паксиліну (100 нМ) ТЕА в концентрації 1 мМ проявляв подальше пригнічення вихідних К+ струмів. ВАХ паксиліннечутливого компоненту виявила, що цей струм проявляє потенціалзалежні властивості, тобто зі збільшенням рівня деполяризації відбувається збільшення його амплітуди. Поряд з цим вольт-амперна характеристика має перегин в області максимуму кальцієвого струму, що може свідчити про залежність цього струму від внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Це вказує на наявність паксиліннечутливого компоненту К+ струмів, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останній має блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так і на КСа проміжної провідності (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). З’ясування природи цього компоненту К+ струму вимагає застосування більш селективних блокаторів К+ каналів.
Другий вагомий компонент КСа струму переноситься через КСа канали малої провідності, для яких селективним блокатором виступає апамін (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та ін. 2000), апамін має побічну дію у вигляді активації каналів, що переносять неселективний катіонний струм. Для усунення невизначеності дії апаміну, в наших дослідах в якості блокатора SК каналів було застосовано d-TK, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів та широко застосовується, як в дослідницьких цілях, так і в медицині (Wenningmann et al. 2001). Але окрім впливу на нікотинові холінорецептори існують дані про його додаткові властивості, як блокатора КСа каналів (Wang et al. 1999, Barfod et al. 2001). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану ГМК taenia cеасі морської свинки.
Ефект блокування IK(Ca) аплікацією d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладення блокатора. IK(Ca), що переноситься через SК канали, не проявляв на відміну від паксилінчутливого струму, часозалежної інактивації та потенціалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в діапазоні + 30, + 50 мВ, що не співпадає з максимумом кальцієвого струму котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ. Подібні ефекти було описано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були пов’язані з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Поряд з цим дослідження, проведені по вивченню впливу d-ТК на вхідні Са2+ струми показали, що d-ТК не впливає на потенціалзалежні Са2+ канали L – типу, котрі були виявлені на мембрані ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та ін. 1986, Зима та ін. 1994), що збігається з літературними даними (Wang et al. 1999).
Окрім наведених відмінностей встановлено, що ВК та SK канали сильно відрізняються по чутливості до ТЕА, неселективного блокатора К+ каналів. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаванні до зовнішнього розчину ТЕА в низьких концентраціях, що в наших дослідах складало 1 мМ. В той же час SK канали, що з успіхом блокувались низькими концентраціями d-ТК (50 мкМ), виявились нечутливими до аплікації ТЕА навіть в концентраціях 4 – 5 мМ, що узгоджується з літературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Більше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявляє блокуючої дії на SK канали навіть в великих концентраціях (20– 25 мМ).
Одною з найважливіших характеристик IK(Ca), що переноситься як через ВК канали так і SK канали, є чутливість цих каналів до зміни [Са2+]i. З літературних джерел відомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фізіологічних умовах [Са2+]i в ГМК знаходиться в діапазоні 100 – 120 нМ. При деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ [Са2+]i різко зростає, досягаючи рівня 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 – 300 нМ, на якому продовжує триматися протягом декількох секунд до припинення деполяризації. Аналогічні дані були отриманні в дослідах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цій роботі було визначено порогову [Са2+]i необхідну для активації К+ каналів, що становила 85 нМ. В той же час для активації ВК каналів необхідна значно вища [Са2+]i, ніж для SК каналів. Проведені досліди з використанням іонів Со2+ в зовнішньому розчині також підтверджують дані, що для активації ВК каналів необхідне значне підвищення [Са2+]i за рахунок надходження іонів Са2+ ззовні клітини, та/або вивільнення їх з внутрішньоклітинного депо.
Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К+ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутливі ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 – 45% для Са2+незалежного К+ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 – 15% для ТЕАчутливого IK та 5 – 15% для d-ТКчутливого IK(Ca), що переноситься через SК канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.