В опублікованих із співавторами працях особистий внесок дисертанта полягає:
- у роботах [4, 7, 8, 10, 11, 12] - у моделюванні цирозу печінки у щурів, проведенні хірургічного втручання та введенні екстрактів, дослідженні стану мікроциркуляторного русла печінки в залежності від умов експерименту;
- у роботі [5] - у моделюванні цирозу печінки у щурів, проведенні хірургічного втручання та введенні екстрактів, аналізі гістологічних препаратів;
- у роботах [3, 6,] - у моделюванні цирозу печінки у щурів, проведенні хірургічного втручання та введенні екстрактів, виконанні біохімічних досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні результати теоретичних та експериментальних досліджень дисертаційної роботи розглядалися на засіданнях і наукових семінарах в ІПКіК НАН України (2004-2007); Міжнародній науково-практичній конференції “Новое в практической медицинской криологии“ (Москва, 2004); Всеукраїнській науково-практичній конференції “Ліки - людині“ (Харків, 2004); щорічній конференції молодих вчених “Холод в біології і медицині” (ІПКіК НАН України, Харків, 2005); Ювілейному VIII з’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Івано-Франківськ, 2005); Конференції з міжнародною участю “Актуальные проблемы и достижения криобиологии и криомедицины. Структурная и функциональная организация стволовых клеток в условиях действия низких температур“ (Харьков, 2005); VII Міжнародній конференції молодих онкологів “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології“ (Київ, 2006); Міжнародній конференції “Cryo-2006, Society for low Temperature Biology” (Гамбург, 2006); XI Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Полтава, 2006); науково-практичній конференції “Профілактика, діагностика та лікування – основні складові терапії“ (Харків, 2006); Всеукраїнській науково-практичній та навчально-методичній конференції “Фундаментальні науки - хірургії“(Полтава, 2007).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 12 наукових праць, серед яких 4 статті у фахових наукових виданнях та 8 тез доповідей у збірниках наукових праць міжнародних, науково-практичних конференцій, з’їздів та конгресів; без співавторів – 3 публікації.
Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 149 сторінках друкованого тексту, з них 123 сторінки основного змісту. Дисертація має вступ, основну частину (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень і їх обговорення), аналіз та узагальнення результатів, висновки. Список використаної літератури (233 джерела) подано на 26 сторінках. Роботу проілюстровано 9 таблицями та 30 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження
Експерименти були проведені на 398безпородних білих щурах-самцях масою 250-300 г. відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах», схвалених ІІ Національним конгресом з біоетики (Київ, 2004 р.) і узгоджених з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).
Щури з експериментальним цирозом були поділені на такі групи:
1 (контроль) - тварини, яким не проводили лікування цирозу печінки (110 щурів);
- тварини після кріодеструкції 8-10% печінки (85 щурів);
- тварини, яким протягом 3-х діб в черевну порожнину вводили по 1 мл суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки новонароджених поросят і селезінки статевозрілих свиней (ЕПС) (87 щурів);
- тварини після кріодеструкції 8-10% печінки, яким протягом 3-х діб в черевну порожнину вводили по 1 мл ЕПС (91 щур).
Групу норми склали 25 тварин.
Експериментальну патологію печінки моделювали введенням 40%-го розчину тетрахлорметану (Б.П.Сандомирський, Н.С. Сігал, К.В. Дубровський, 1992). Смертність складала близько 35% від загальної кількості експериментальних тварин.
Кріодеструкцію циротично зміненої печінки здійснювали на 5-ту добу після закінчення введення тетрахлорметану. Тварин піддавали наркозу, здійснювали серединну лапаротомію, на лівій латеральній частці печінки виконували кріодеструкцію за допомогою автономного азотного кріоінструмента з діаметром аплікатора 2,0 мм та температурою на поверхні –120оС. Кріовплив протягом 2 хв призводив до утворення зон заледеніння, що становили 8-10% загальної маси органа. Рану черевної порожнини ушивали пошарово з дотриманням правил асептики.
В роботі використані водно-сольові екстракти, одержувані з кріоконсервованих фрагментів печінки новонароджених поросят і селезінки статевозрілих свиней з вмістом поліпептидів 100 мкг/мл (С.Є. Гальченко, 2004).
Мікрогемоциркуляцію досліджували методом вітальної мікроскопії (І.В. Слета, 2002), який дозволяє оцінити швидкість кровотока, визначити діаметр і контури внутрішньої і зовнішньої стінок мікросудин, кількість функціонуючих мікросудин, взаємодію формених елементів крові. Прижиттєву мікроскопію печінки здійснювали за допомогою контактного мікроскопа Люмам К-1 в режимах поляризації і люмінесценції.
Внутрішньовенне введення флюоресцеїну натрію (ураніну) дозволило охарактеризувати стан кровотока і транспорт ураніну в органі. Розподіл мітки в печінці та інтенсивність її світіння оцінювали візуально при мікроскопії або на фотознімках об'єкта, одержаних за допомогою цифрового фотоапарата Sony.
Для дослідження мікрогемоциркуляції відеореєстрацію мікросудин печінки з об'єктива мікроскопа Люмам К-1 проектували на чорно-білу телекамеру Panasonic VC 45 BSHRX-12 і вводили в комп'ютер в режимі on line. Аналіз одержаних зображень проводили за допомогою комп'ютерної програми «FRAM», призначеної для розрахунків морфометричних характеристик об'єкта (Д.Г. Луценко и др., 2005).
Інтегральним показником стану мікрогемоциркуляції органа може слугувати фрактальна розмірність D, за якою визначаються мікроархітектоніка судинного русла, діаметр судин, швидкість і характер кровотока, а також стан формених елементів крові в судинах. Значення D розраховували як кутовий коефіцієнт прямої, що апроксимує залежність кількості пікселів заданого забарвлення біооб'єкта від площі рамки, до якої вони потрапляють (Б. Мандельброт, 2002; Д.Г. Луценко, 2005).
Для гістологічних досліджень фрагменти печінки фіксували в 10%-му нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Одержані з парафінових блоків зрізи завтовшки 6-8 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином для отримання оглядових гістологічних препаратів. Стан сполучної тканини оцінювали в препаратах, забарвлених пікрофуксином по ван Гізон для виявлення колагенових волокон (О.В.Волкова и др., 1982).
Вміст ТБК-активних продуктів (ТБКАП)в сироватці крові визначали спектрофотометрично (В.В. Меньшикова, 1987).
Активності аланін- і аспартатамінотрансфераз (АлАТ і АсАТ) досліджували за методом Райтмана-Френкеля за допомогою стандартних наборів виробництва НПП "Фелісит діагноста" (Дніпропетровськ, Україна).
Статистичну обробку результатів проводили параметричним методом Фішера-Стьюдента з використанням t-критерію або непараметричним методом ANOVA. Кількісні дані в тексті дисертації представлені в середніх величинах і середніх квадратичних похибках. Для статистичної обробки результатів використовували пакет програм Statistica for Windows 5.1.
Результати власних досліджень та їх обговорення
Особливості мікроциркуляції крові в циротично зміненій печінці після кріогепатодеструкції, введення ксеноекстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки та їх поєднаної дії. Через 2 місяці з початку введення гепатотропної отрути щури були мляві, малорухомі, мали на череві пожовтілий смух. При макроскопічному дослідженні їхня печінка мала темно-бурий кольор, була щільна, пружна, горбиста, з нерівним краєм. У черевній порожнині визначалася асцитна рідина.У інтактних тварин печінка була бурого кольору, гладенька, еластична, з рівними краями.
Дослідження мікроциркуляції крові в печінці інтактних тварин показали, що кровоток в мікросудинах венулярного типу був швидкий, безперервний, гомогенний, із збереженням пристінного плазматичного шару. Функціонуючі синусоїди мали нормальне наповнення, їх діаметр складав 9,28±2,18 мкм. Термінальні печінкові венули мали середній діаметр 18,75±2,51 мкм. Відносна площа судинного русла у полі зору – 52,5±1,6 %.
Метод прижиттєвої мікроскопії в режимі люмінесценції дозволив досліджувати не тільки стан мікросудин печінки, але й жовчних канальців в поверхневих шарах паренхіми органа. Як люмінесцентну мітку застосовували внутрішньовенно введений 2% -й розчин ураніну. Його максимальне світіння в термінальних печінкових венулах спостерігалося в перші 5-10 хв після ін'єкції, потім уранін виходив за межі мікросудин, викликаючи однорідне світіння паренхіми. У наступні 10 хв флюоресціююча мітка проникала в жовчні канальці, внаслідок чого вони ставали видимими для спостереження. У нормальній печінці жовчні канальці утворювали рівномірну мережу з яскравим світінням.
Мікрогемоциркуляторне русло печінки щурів після двомісячного введення тетрахлорметану (1 група) відповідало картині цирозу печінки. При цьому спостерігалися різке зменшення кількості функціонуючих синусоїдів і присутність феномена звивистості. Діаметр термінальних портальних венул був зменшений, а діаметр печінкових венул – значно збільшений. Відносна площа судинного русла була вдвічі менша за норму і становила 27,35±2,92% у полі зору. Спостерігалася значна кількість шунтуючих судин. Порушення мікрогемоциркуляції виявлялося також у внутрішньосудинній агрегації еритроцитів, уповільненні кровотока, виключенні з кровотока частини синусоїдів. При введенні розчину ураніну виявлялись зміни в архітектоніці жовчних канальців. При цирозі спостерігалось різке зменшення жовчних канальців в полі зору, вони були потовщені, випрямлені, без сітчастої структури.