Статистичну обробку результатів досліджень робили з використанням комп'ютерних програм “STATGRAPHICS Plus” і “Microsoft Office Excel”.
Використані в дисертаційній роботі матеріали і методи були розглянуті та узгоджені з комісією з біоетики ІПК і К НАН України.
Результати досліджень та їх обговорення
Найбільш інформативним критерієм оцінки функціональної повноцінності та розподілу КФНК є їх ідентифікація після введення в організмі реципієнта.
Для ідентифікації, вивчення шляху і часу міграції клітин у ранній термін спостереження використовували генетичну мітку, яка досить консервативна, тому що не піддається розпаду, і для неї не характерні явища обміну між клітинами.
Така генетична мітка залишається в дочірніх клітинах і при розподілі в організмі доказує присутність утримуючих Y-хромосому клітин у патологічному осередку.
В експериментальному оці при парабульбарному введенні КФНК через шість годин, клітини що містять Y-хромосому, визначаються в склері, радужці, зоровому нерві, у судинній і сітчастій оболонці ока, тоді як у тканинах контрольного ока в цей термін спостереження клітини не визначаються.
До 12-ї години спостереження картина змінилася. У судинній, сітчастій оболонці і зоровому нерві експериментального ока зберігаються клітини, які утримують Y-хромосому. На цьому етапі спостереження, клітини, що утримують У-хромосому з'являються в головному, довгастому мозку, мозочку, кістковому мозку, а також у судинній і сітчастій оболонках контрольного ока.
Через 24 години після введення клітин, що містять Y-хромосому, визначаються тільки у судинній і сітчастій оболонках експериментального ока, а також зберігаються в структурах головного, довгастого мозку, мозочку і кістковому мозку, тоді як у контрольному оці клітки утримуючі Y-хромосому відсутні. Через 72 години спостереження картина залишається без змін.
У результаті проведених досліджень встановлено, що введені нервові клітини володіють високою тропністью до патологічного осередку і вірогідно визначаються в травмованому оці протягом 3-х діб. Отримані нами дані свідчать про розподіл нервових клітин протягом 72 годин після введення. Однак, важливо встановити, чи зберігають вони свою функціональну активність і як розподіляються в організмі КФНК у більш тривалий період спостереження. Для цього ми провели експериментальні дослідження з використанням флюоресцентного зонда DDC.
В проміжки спостереження від 3 до 21-ї доби відзначалося скупчення мічених клітин, що мають інтенсивне зелене світіння, це свідчить про проникнення нервових клітин через гематоофтальмічний бар'єр та про їх спрямованість до осередку поразки і проникнення в сітчасту оболонку реципієнта. Найбільш інтенсивне зелене світіння сітчастої оболонки спостерігалось у препаратах з 3-ї до 7-ї доби, тоді як до 21-ї доби відзначалася тенденція до зниження його інтенсивності.
Даний метод дозволяє реєструвати високий рівень флюоресценції у осередку поразки, що може свідчити про наявність в ньому нервових клітин протягом тривалого часу.
Безумовним об'єктивним доказом ефективності проведеної терапії є патоморфологічне дослідження органів, клітин і тканин. Гістологічне дослідження показало, що після лазерного впливу в 1-шу добу відновного періоду відзначаються альтеративні зміни в шарі пігментного епітелію і мембрані Бруха. Гранули пігменту виходять у шар фоторецепторів і судинну оболонку і щільність зерен пігменту стає неоднорідною.
Між паличками і колбочками розташовуються еритроцити, що вийшли із судин, визначається набряклість міжуточної речовини, яка має вигляд порожніх щілин.
Також у цьому періоді відзначаються тромбоз судин хоріоідеї, часткове руйнування пігментного епітелію і шарів сітківки.
Доведено, що утворення істинного хоріоретинального зрощення пов'язано з утворенням фіброзних волокон у зоні ушкодження.
Через 3-и доби після введення КФНК спостерігаються розсмоктування крововиливів, зменшення набряку міжуточної речовини сітківки.
Зміни, характерні для часткового відновлення сітківки, спостерігаються вже через тиждень. Так, пігментний епітелій проліферує в один чи декілька шарів сітківки; пігментні клітини розташовуються навколо ретинальних судин або мігрують у внутрішні шари сітківки, де утворюють скупчення.
У тварин основної групи на 7-му добу після введення КФНК у сітчастій оболонці відзначаються зменшення набряку міжуточної речовини, перерозподіл гранул пігменту з тенденцією до нормалізації анатомічної структури, тоді як у контрольній групі в цей термін спостереження зберігаються альтеративні зміни з набряком межуточної речовини сітківки, крововиливами, аномальним перерозподілом пігменту.
До 14-ї доби після введення КФНК у тварин дослідної групи зберігається тенденція до нормалізації морфологічної структури сітчастої оболонки. Визначаються мінімальні альтеративні зміни.
Результатом фотокоагуляції сітківки є проліферація пігментного епітелію й утворення хоріоретинального зрощення, що на очному дні при лазерній скануючій томографії має вигляд дистрофічних осередків блідо-жовтого чи білого кольору.
У тварин контрольної групи у відповідний термін спостережень у зоні ушкодження зберігався набряк і перерозподіл пігменту.
Застосування КФНК стимулює репаративні процеси при лазерному ушкодженні сітківки ока в кролів і є високоефективним методом структурного відновлення сітківки.
Ми вивчили вміст окремих нейротрофічних факторів (GNF, TGF β-1), що беруть безпосередню участь у репарації сітківки (рис. 1 та 2).
З отриманих даних видно, що на 3-тю добу після лазерного опіку сітківки у всіх групах піддослідних тварин відзначалося різке підвищення рівня вмісту TGF β-1 у плазмі крові. При цьому мали місце виразні і достовірні розходження в ступені підвищення вмісту даного фактора між групами тварин, що не одержували клітинну терапію (мимовільне загоєння опіку сітківки і лікування за стандартною схемою), і тварин, яким вводили КФНК (внутрішньовенно і парабульбарно).
У контрольній групі відзначено підвищення показника тільки в 2 – 2,5 рази, що склало при спонтанному загоєнні після лазерного опіку сітківки 255%, а за стандартною схемою лікування 239% (p<0,01), відповідно до норми (інтактні кролі -100%). У тварин дослідних груп, із застосуванням КФНК рівень вмісту TGF β-1 підвищувався відповідно норми в 4-5 разів, при внутрішньовенному введенні складав 562%, при парабульбарном введенні 436% (p<0,001) і був у середньому в 2 рази вище показників у контрольній групі.
На 3-ю добу після опіку були зафіксовані розходження рівня вмісту TGF β-1 у залежності від шляху введення КФНК. У групі тварин, яким КФНК вводили внутрішньовенно, вміст ростового фактора TGF β-1 в плазмі крові був достовірно вище у 1,3 рази (p<0,05), ніж у кроликів з парабульбарным введенням (рис. 1.).
Отримані дані свідчать, що травматичне ушкодження сітківки ока викликало різкий викид ростового фактора репарації TGF β-1.
На 3-ю добу після травми в плазмі крові тварин, що одержували клітинну терапію, відзначається більш високий рівень TGF β-1, тому можна припустити, що введені фетальні нервові клітини стимулюють продукцію біологічно активних речовин, необхідних для репаративних процесів у сітчастій оболонці. Більш високий вміст досліджуваного TGF β-1 у плазмі крові тварин, якім внутрішньовенно вводили клітинний препарат, може вказувати на те, що частина клітин залишається в загальному циркуляторному руслі і не відразу досягає осередку поразки.
На 7-му добу після ушкодження вміст TGF β-1 значно знижувався у всіх групах. У кролів з мимовільним загоєнням опіку сітківки визначався дефіцит TGF β-1 і складав 78,3%, тобто досліджуваний показник був нижче на 22% (p <0,05), ніж у інтактних кролів. У кролів, яких лікували за стандартною методикою, вміст TGF β-1 значно перевищував нормальні показники в 1,7 рази (Р<0,05) і складав 172%.
На 7-му добу спостережень найбільш високі показники TGF β-1 були у кролів, що одержували клітинну терапію. Вміст TGF β-1 перевищував нормальне значення в 3,6-3,8 рази і складав при внутрішньовенному введенні КФНК – 381%, при парабульбарному – 363% (p<0,001), а також перевищував вміст TGF β-1 у контрольній групі кролів в цей термін спостереження.
При цьому до 7-ї доби спостереження достовірних розходжень між показниками вмісту TGF β-1 у групах тварин, яким вводили КФНК різними шляхами, не спостерігалося.
На 14-ту добу спостережень вміст ростового фактора TGF β-1 у нелікованих кролів був на 20% нижче норми і складав – 79,5%. В групі кролів зі стандартним лікуванням TGF β-1 складав – 104,5%. У групах кролів, що одержували КФНК, вміст TGF β-1 перевищував нормальний у 2,5-2,7 рази (p<0,01) і складав при внутрішньовенному введенні КФНК 247%, а при парабульбарному 270%.
На 21-шу добу спостережень у тварин із спонтанним загоєнням опіку сітківки і яких лікували за стандартною схемою, рівень вмісту досліджуваного показника нормалізувався.
У тварин після проведення клітинної терапії на 21-шу добу на тлі практично повного загоєння ранового дефекту відзначалося підвищення значення TGF β-1 у 1,7-2 рази (p<0,05), що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 175,6%, при парабульбарному – 196%.
До кінця першого місяця після нанесення лазерного опіку сітківки дослідних тварин усіх груп рівень TGF β-1 у плазмі крові цілком нормалізувався і залишався таким до шести місяців спостереження.
В якості специфічного ростового фактора для клітин нервової тканини ми вивчали рівень вмісту GNF (рис. 2.).
Представлені дані свідчать про те, що на 3-тю добу після нанесення лазерного опіку сітківки підвищення вмісту GNF у плазмі крові (у 3-4 рази відповідно до норми – 100%) відзначалося тільки у тварин, які одержували КФНК, що складало при внутрішньовенному введенні КФНК – 461%, а при парабульбарному – 351%.