Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно підготовлено огляд літератури за темою дисертації, отримано експериментальні дані, проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів досліджень. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:
– в роботах [2,6,7,8,9] у визначенні інтенсивності ПОЛ в системах “тромбоцити-плазма”, “тромбоцити-плазма-кріопротектор”; дослідженні здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі; проведенні статистичної обробки отриманих результатів;
– в роботах [1,3,4,5] у здійсненні виділення концентратів тромбоцитів, плануванні та проведенні експериментів з дослідження впливу методу виділення концентратів тромбоцитів, кріопротекторів, режимів заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів; відпрацюванні способу видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів; проведенні статистичної обробки отриманих результатів; визначенні ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі; відпрацюванні методики приготування цитологічних препаратів та проведенні люмінесцентної мікроскопії.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічній конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод у біології і медицині” (Харків, 2005 рік); конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005” (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005 рік); 4-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленськ, Росія, 2005 рік), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 рік).
Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 9 робіт, з яких: 4 наукових статті у спеціалізованих фахових виданнях, 4 тез доповідей на наукових конференціях, 1 деклараційний патент на корисну модель.
Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 162 сторінках друкованого тексту, з яких 124 сторінки основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаних літературних джерел (22 сторінки), що вміщує 222 джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями та 48 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень
Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані фракціонуванням донорської крові, заготовленої на консерванті “Глюгіцир” в полімерні контейнери “Гемакон”. Виділення КТ здійснювали двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) [Волкова Р.И. и др., 1992] та з лейко-тромбоцитарного шару (ЛТШ) [Аграненко В.А. и др., 1991]. Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах “Компопласт” до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC в умовах постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв. У межах 2 – 4 годин після виділення КТ визначали його кількісний склад [Перфильева Е.А. и др., 2003; Ронин В.С., 1983].
У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин (ГЛ), оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 (ОЕГn=5), очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали при 22 ± 2 єC у відповідності до рекомендованих схем [ArnaudF.G. etal., 1990; Компаниец А.М., 1992; 1995; WoodsE.J. etal., 1999]. Дослідження здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі їх генерації проводили за методом [HalliwellB. еt al., 1987]. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” здійснювали за методом [AsakawaJ., 1980]. Кінцеві концентрації ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складали 0,5; 0,7 та 1 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М; час експозиції КТ з кріопротекторами – 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” визначали за методом [Владимиров Ю.А., 1972] одразу після введення індуктора та через 15 і 30 хвилин. Кінцева концентрація ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складала 0,7 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М.
Морфофункціональні властивості тромбоцитів: здатність накопичувати АО [Деменко В.Д. и др., 1990], здатність до індукованої АДФ та колагеном агрегації [BornG.V.R., 1962], реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) [Компаниец А.М., 1992] досліджували у межах 2 – 4 годин після виділення КТ та після 18 – 24 годин зберігання, а також після експозиції КТ з ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ у кінцевих концентраціях 0,7 та 1,4 М протягом 5; 30 хвилин і наступного видалення кріопротекторів розробленим способом [Пат. № 15014 Україна, 2006]. Агрегаційну здатність тромбоцитів додатково визначали у присутності вищезазначених кріопротекторів у кінцевій концентрації 0,1 М. Ступінь пошкодження кров’яних пластинок на етапах виділення та зберігання КТ визначали за активністю у супернатанті ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) [Лемешко В.В. и др., 1989]. Ступінь пошкодження тромбоцитів на етапі експозиції КТ з кріопротекторами визначали за активністю у супернатанті ферментів: ЛДГ та Г6ФДГ [Родионова В.Л. и др., 2005]. Кінцеві концентрації ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ складали 0,7 М, а комбінацій ДМАЦ + 1,2-ПД: 0,7 та 0,35 М; час експозиції КТ з кріопротекторами та їх комбінаціями становив 15 хвилин.
Кріозахисні розчини (1,4 М ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ДМАЦ + 1,2-ПД та 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД на плазмі, плазма без кріопротектора) вводили в КТ у співвідношенні 1:1 при 22 ± 2 єC протягом 1 хвилини, одразу після чого здійснювали заморожування зразків за допомогою програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у кріоампулах “Nunc”. Об’єм зразка становив 1,6 мл.
При порівняльному дослідженні ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома методами, застосовували ДМСО у кінцевій концентрації 0,7 М та програму заморожування №1.
При дослідженні впливу процедури заморожування КТ в температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 °C) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів застосовували наступні програми:
програму №1: охолодження зразка від 22 ± 2 °C до -35…-40 °C проводили зі швидкістю 1°C/хв, після чого – занурювали у рідкий азот;
програму №2: зразок охолоджували аналогічно програмі №1, але додатково вводили процедуру температурної ініціації кристалізації, після чого застосовували контрольовану швидкість охолодження 6 – 7 °C/хв;
програму №3: охолодження зразка проводили аналогічно програмі №2, але після процедури температурної ініціації кристалізації зменшували швидкість його охолодження до 0,2 – 0,3 °C/хв.
Заморожування зразків за зазначеними програмами здійснювали з кріопротектором та без нього. При застосуванні програм, що передбачали процедуру температурної ініціації кристалізації, величина переохолодження не перевищувала 0,5 – 1 °С.
При дослідженні впливу швидкості заморожування КТ з ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…40 до -80 єC) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів застосовували програми №4 – №7 (табл. 1).
Показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів, отримані після кріоконсервування КТ за програмами №4 – №7, порівнювали з відповідними показниками після заморожування КТ того ж донора за програмами №1, №2 та №8 [BalintB. еtal., 2006], що за даними літератури забезпечує високий рівень збереженості кров’яних пластинок. При дослідженні кріозахисної ефективності середовищ різного композиційного складу застосовували програми заморожування №1 та №2.
Таблиця 1
Програми заморожування №4 – №7
| Прог-рами | Швидкість охолодження в температурних інтервалах | ||
| від 22 ± 2 до -35…-40 °C | від -35…-40 до -80 °C | від -80 до -196 °C | |
| №4 | 1 °C/хв | 0,5 – 1 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №5 | 1 °C/хв | 5 – 7 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №6 | 1 °C/хв | 10 – 15 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №7 | 1 °C/хв | 25 – 30 °С/хв | занурення в рідкий азот |
Відігрівання зразків здійснювали на водяній бані при 37 °C, одразу після чого проводили оцінку кількісної збереженості тромбоцитів та визначення ступеня їх пошкодження за активністю в супернатанті цитозольних ферментів. Ступінь пошкодження тромбоцитів після термоциклювання (Т) приймали за 100 %. Морфофункціональні показники кріоконсервованих клітин визначали після видалення кріопротектора.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили із застосуванням критерію Стьюдента та непараметричного критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.
Результати досліджень та їх обговорення
Відомо, що процедура отримання КТ спричиняє зміну морфофункціонального стану певної частини кров’яних пластинок, їх активацію [BodeA.P., 1990; EstebanellE. etal., 2000]. Ступінь активації залежить від умов та способу виділення клітин [BцckM. etal, 2002]. На першому етапі досліджень, при оцінці морфофункціонального стану тромбоцитів, виділених з донорської крові двома різними методами, ми застосували люмінесцентну мікроскопію, яка базується на здатності кров’яних пластинок акумулювати в гранулярному апараті флуорохром АО. Порівняльний аналіз співвідношення морфологічних форм тромбоцитів в препаратах ЗТП та КТ показав, що останні містять значно більшу кількість активованих гранулярних, агранулярних форм (рис. 1) та агрегатів тромбоцитів, характеризуються нижчим показником гранулярності та вищим ступенем мікровезикуляції (табл. 2). Зазначені ознаки активації тромбоцитів виявилися більш вираженими в препаратах КТ із ЗТП, ніж КТ з ЛТШ.