Таблиця 2
Показники активації тромбоцитів ЗТП, КТ з ЛТШ та КТ із ЗТП (М ± у, n = 6)
| Показники | Компонент | ||
| ЗТП | КТ з ЛТШ | КТ із ЗТП | |
| Агрегати тромбоцитів (в полі зору) | 0 – 1 | 2 – 3 | 4 – 6 |
| Мікровезикуляція | – / + | ++ | +++ |
| Показник гранулярності | 4,5 ± 0,4 | 2,8 ± 0,6 | 1,9 ± 0,7* |
Примітка: * – відмінності статистично достовірні порівняно з відповідним показником ЗТП, та КТ з ЛТШ, РU<0,05.
У межах 2 – 4 годин після виділення КТ спостерігалося значне пригнічення індукованої АДФ і колагеном агрегації кров’яних пластинок у порівнянні з даними для ЗТП (рис. 2А, 2Б). При цьому агрегація тромбоцитів КТ з ЛТШ була достовірно вищою від агрегації тромбоцитів КТ із ЗТП. Протягом наступних 18 – 24 годин зберігання КТ при 22 ± 2 єС агрегаційна здатність тромбоцитів дещо відновлювалася. Показники агрегації тромбоцитів КТ з ЛТШ достовірно не відрізнялися від відповідних показників тромбоцитів ЗТП. Агрегаційна здатність тромбоцитів КТ із ЗТП залишалася значно нижчою, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ. Ступінь РГШ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ в межах 2 – 4 годин після виділення (рис. 2В). Після 18 – 24 годин зберігання при 22 ± 2 єС не виявлено достовірних відмінностей між показниками РГШ тромбоцитів КТ, виділених різними методами. Активність ЛДГ після виділення КТ обома методами була значно вищою порівняно з активністю ферменту у ЗТП до виділення КТ. Виявлено також суттєві відмінності між активністю ЛДГ у КТ, отриманих різними методами. Отже, результати досліджень показали, що обрані нами методи виділення КТ спричиняють різний ступінь активації/травматизації тромбоцитів.
Наступним етапом роботи було порівняльне дослідження ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома різними методами. Виявилося, що кріоконсервування КТ з ДМСО за програмою №1 призводить до значного порушення або втрати здатності тромбоцитів до накопичення АО. Про це свідчить збільшення у КТ після відігрівання вмісту активованих форм тромбоцитів та наявність формених елементів, що не включають флуорохром –акридин-негативних (рис. 1).
Для кращої репрезентації здатності популяції в цілому до накопичення АО ми ввели інтегральний показник – індекс акумуляції флуорохрому (ІАФ), для обчислення якого застосували формулу Астальді і Верга [Меньшиков В.В., 1982]. Розрахований для зразків ЗТП ІАФ (2,84 ± 0,057) виявився достовірно вищим порівняно з ІАФ, розрахованими для КТ із ЗТП (1,57 ± 0,039) та КТ з ЛТШ (1,75 ± 0,058). ІАФ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж ІАФ КТ з ЛТШ не тільки до, а й після кріоконсервування (відповідно 0,79 ± 0,025 та 0,98 ± 0,023).
У результаті кріоконсервування значно порушувалася також агрегаційна здатність тромбоцитів та РГШ (рис. 2). Встановлено, що збереженість цих морфофункціональних властивостей тромбоцитів після відігрівання значною мірою залежить від ступеня активації/травматизації останніх перед заморожуванням. Саме тому вибір способу одержання тромбоцитів для подальшого їх кріоконсервування є надзвичайно важливим. Метод виділення КТ з ЛТШ забезпечує менший ступінь активації кров’яних пластинок, нижчий вміст тромбоцитарних агрегатів та залишкових клітин і, як результат, – вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей клітин після кріоконсервування. У подальших експериментах з кріоконсервування ми використовували КТ, виділені з ЛТШ.
Активація вільнорадикальних процесів із залученням мембранних ліпідів при заморожуванні-відігріванні сприяє поглибленню структурної дезорганізації мембран та розвитку їх деструкції [RichterE. etal., 1985; Белоус А.М., 1997]. Порівняльне дослідження антирадикальних властивостей органічних сполук різних хімічних класів, що найчастіше застосовуються при низькотемпературному консервуванні тромбоцитів, показало: всі кріопротектори з ряду досліджених мають здатність перехоплювати гідроксильні радикали в модельній системі їх генерації і за даною властивістю розташувалися у порядку зростання: ГЛ < ДМАЦ < ОЕГn=5 ≈ 1,2-ПД < ДМСО. Метою наступного етапу нашої роботи було дослідити, яким чином впливає введення кріопротекторів у концентраціях, що використовуються при кріоконсервуванні тромбоцитів крові людини, на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Вміст ГПЛ у системі “тромбоцити-плазма” достовірно не підвищувався після введення у неї ДМАЦ і 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,5 та 0,7 М (рис. 3). Введення у систему “тромбоцити-плазма” ДМСО, гліцерину, ОЕГn=5 у будь-якій концентрації та 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 1 М супроводжувалося достовірним підвищенням вмісту ГПЛ порівняно з контролем. Протягом наступних 30 хвилин не відбувалося достовірних змін вмісту ГПЛ в окремо взятих системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” незалежно від концентрації останнього.
Присутність у системі “тромбоцити-плазма” таких кріопротекторів, як ГЛ та ОЕГn=5 у досліджуваних концентраціях призводила до достовірного підвищення інтенсивності індукованого іонами заліза ПОЛ порівняно з контролем (рис. 4). Інтенсивність індукованого ПОЛ у системі за присутності ДМАЦ, 1,2-ПД та ДМСО у концентрації 0,7 М залишалася на рівні контролю.
Очевидно, характер впливу кріопротектора на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”, перш за все, визначається його хімічною природою та концентрацією. Можливо, структурні зміни мембрани, пов’язані з відносно швидким додаванням повільно проникаючого через мембрану тромбоцитів ГЛ та непроникаючого ОЕГn=5, роблять її більш чутливою до окислювальних впливів. Нам не вдалося виявити залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі та характером їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”.
Важливою умовою адекватної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування є максимальне видалення кріопротектора із суспензії кров’яних пластинок. Процедура видалення кріопротекторів, яку зазвичай здійснюють центрифугуванням з наступним ресуспендуванням осаджених клітин у плазмі, призводить до додаткового суттєвого пошкодження кров’яних пластинок [ZilberM. etal., 2003; SchoenfeldH. etal., 2005]. Нами був розроблений і апробований спосіб максимального видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Застосування розробленого способу в наших дослідженнях дозволило отримати більш достовірну інформацію щодо впливу кріопротекторів та інших факторів кріоконсервування на морфофункціональний стан тромбоцитів.
Дослідженнями встановлено, що експозиція КТ з ДМСО, ДМАЦ та 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М не супроводжується помітними змінами морфофункціональних властивостей тромбоцитів: здатності до акумуляції АО, індукованої АДФ та колагеном агрегації, РГШ. Достовірні зміни морфофункціональних властивостей тромбоцитів спостерігалися при підвищенні концентрації кріопротекторів у суспензії клітин до 1,4 М: у КТ збільшувався вміст активованих форм та агрегатів, зменшувався показник гранулярності, змінювалися показники агрегаційної здатності та РГШ. Так як обрані кріопротектори у кінцевій концентрації 0,7 М не викликали значних змін морфофункціонального стану тромбоцитів, у подальших експериментах з кріоконсервування вони застосовувалися у даній концентрації.
Відомо, що одним із відповідальних етапів при низькотемпературному консервуванні є охолодження біологічного об’єкта в температурному інтервалі кристалізації кріобіологічної системи. Значний вплив на характер кристалізаційних процесів мають швидкість охолодження та ступінь переохолодження [Белоус А.М. и др., 1987]. На першому етапі було досліджено вплив процедури заморожування КТ з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC на ступінь пошкодження тромбоцитів, визначений за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі, та на показники їх морфофункціональної збереженості. Отримані результати свідчать, що заморожування за програмою №2, яка передбачає застосування процедури температурної ініціації кристалізації, має результатом значно менший ступінь пошкодження тромбоцитів, ніж заморожування за лінійною програмою №1 (рис. 5). Причому, в присутності кріопротектора значення процедури ініціації кристалізації було помітно меншим, ніж за його відсутності. Не виявлено достовірних відмінностей між показниками пошкодження тромбоцитів після заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з ініціацією кристалізації та після кріоконсервування КТ з 0,7 М ДМСО за лінійною програмою №1. Так як програма №2 передбачає застосування не тільки процедури ініціації кристалізації, а й наступної контрольованої (6 – 7 °C/хв) швидкості охолодження, ми вирішили дослідити значення швидкості охолодження кріобіологічної системи після ініціації кристалізації. Для цього додатково застосували програму №3, що забезпечувала швидкість охолодження в зазначеному температурному інтервалі 0,2 – 0,3 °C/хв. Ступінь пошкодження тромбоцитів, заморожених з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора за програмою №3, виявився достовірно вищим, а рівень збереженості функціональних властивостей – нижчим, ніж заморожених за програмою №2. Зменшення швидкості охолодження призвело до збільшення часу знаходження клітин у системі, що кристалізується. Очевидно, основним механізмом пошкодження клітин за цих умов став так званий “ефект розчину”, значення якого в присутності кріопротектора було помітно меншим. Отже, лише поєднання процедури зняття переохолодження з наступною певною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі кристалізації може забезпечити істотне зниження ступеня пошкодження кров’яних пластинок.