Дослідженнями останніх років виявлено явище низькотемпературного евтектичного розшарування розчину ДМСО і показано, що даний фізичний чинник може викликати летальні пошкодження кріолабільних клітин [KyryliukG.L. etal., 2006]. Зменшити його вплив запропоновано шляхом проходження температурного інтервалу, в якому відбувається евтектичне розшарування розчину кріопротектора, з підібраною експериментально швидкістю охолодження. Тому важливим було дослідити вплив швидкості заморожування КТ з 0,7 М ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC) на ступінь пошкодження кров’яних пластинок. З підвищенням швидкості проходження даного температурного інтервалу (від 0,5 – 1 до 25 – 30 єC/хв) спостерігалася тенденція до зменшення ступеня пошкодження кріоконсервованих тромбоцитів (рис. 6). Але швидкість, що реалізувалася при прямому зануренні зразка у рідкий азот (програма №1), була занадто великою, про що свідчить підвищення активності Г6ФДГ і ЛДГ у позаклітинному середовищі (р<0,05). Показники агрегації тромбоцитів, кріоконсервованих за програмами з різними швидкостями охолодження в зоні евтектичних температур, достовірно не відрізнялися між собою. Достовірні відмінності виявлені між показниками РГШ тромбоцитів, заморожених за програмами №1 та №7, 8.
Ступінь пошкодження тромбоцитів після кріоконсервування за програмою Balint B. (№8), яка передбачала проходження з різною контрольованою швидкістю інших температурних інтервалів, достовірно не відрізнявся від аналогічних показників після кріоконсервування за програмами №2,4,5,6,7. Ефективність даної програми заморожування виявилася достовірно вищою порівняно з програмами №1 та №3 (рис. 5; 6).
Таким чином, швидкість охолодження суспензії тромбоцитів у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур є фактором, що має визначальний вплив на ефективність кріоконсервування КТ.
Дослідження впливу композиційного складу середовища кріоконсервування на морфофункціональні показники кріоконсервованих тромбоцитів показали, що найвищий рівень збереженості індукованої АДФ агрегації забезпечив ДМАЦ та його комбінації з 1,2-ПД (рис. 7А). За здатністю зберігати дану властивість тромбоцитів досліджені кріопротектори та їх комбінації розмістилися в порядку зростання: 0,7 М 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМСО < 0,7 М ДМАЦ ≈ 0,35 М ДМАЦ + 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД. Найбільш високий рівень збереженості індукованої колагеном агрегації тромбоцитів забезпечив ДМСО при застосуванні програми заморожування №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7Б). Не виявлено достовірних відмінностей між даною здатністю тромбоцитів, кріоконсервованих з ДМСО за програмою №1 без ініціації кристалізації, з ДМАЦ за обома програмами та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2.
Найвищий ступінь збереженості РГШ спостерігався після кріоконсервування КТ з ДМСО за обома програмами та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7В). Причому, за даним тестом не виявлено достовірних відмінностей між результатами кріоконсервування КТ з ДМСО за лінійною програмою №1 та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації. Відмінностей між ступенем агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених за різними програмами в однакових за складом кріозахисних середовищах, також не виявлено (р>0,05). Достовірно вищі показники агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених з 0,35 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2, ніж за програмою №1, свідчать про те, що зі зменшенням вмісту кріопротектора у кріозахисному середовищі значення програми заморожування зростає.
Здатність ДМАЦ у досліджених концентраціях суттєво пригнічувати активність ЛДГ та Г6ФДГ, ускладнила аналіз даних, отриманих за даним тестом. Оцінка ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі виявилася прийнятною при порівнянні ефективності програм заморожування за умови використання одного кріопротектора, або кріопротекторів різних хімічних класів, які не впливають на активність зазначених ферментів. За даним тестом ефективність кріоконсервування за програмою з ініціацією кристалізації є вищою, ніж за програмою без ініціації кристалізації при застосуванні всіх досліджуваних кріопротекторів і їх комбінацій (рис. 8). Кріоконсервування з ДМСО має результатом менший ступінь пошкодження, ніж кріоконсервування з 1,2-ПД та 0,35 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД.
Вперше для оцінки кріоконсервованих тромбоцитів нами був застосований метод люмінесцентної мікроскопії з використанням АО. Найбільша кількість акридин-негативних форм спостерігалася після кріоконсервування з ДМАЦ та 1,2-ПД (відповідно 53 ± 6 % та 49 ± 8 %). Не виявлено достовірних відмінностей між вмістом акридин-позитивних і гранулярних тромбоцитів після кріоконсервування з ДМСО (відповідно 67 ± 8 % і 29 ± 4 %) та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД (відповідно 0,7 М: 47 ± 4 % і 14 ± 5,6 %; 0,35 М: 57 ± 4 % і 25 ± 6,5 %). Слід зазначити, що КТ, заморожені без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації за субпопуляційний складом займали проміжне положення між КТ, кріоконсервованими з ДМАЦ і 1,2-ПД з одного боку та КТ, кріоконсервованими з ДМСО і комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД з іншого: акридин-позитивних – 55 ± 5,6 %, гранулярних – 20 ± 5 %. Заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації мало результатом значно вищий вміст акридин-позитивних та нижчий – акридин-негативних тромбоцитів порівняно із заморожуванням за лінійною програмою №1.
Аналіз результатів дослідження кріопротекторної активності обраних органічних сполук показав, що за показниками структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Отримані дані дозволяють рекомендувати дану комбінацію кріопротекторів у якості основи кріозахисного середовища при розробці технології низькотемпературного консервування тромбоцитів для клінічного застосування.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.
1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.
2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.
3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 ≈ 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.
4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.
5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.