НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Книш Оксана Василівна
УДК: 547.42:612.111.7
ВПЛИВ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ
14.01.35 – кріомедицина
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник:
доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава
доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені Г. C. Сковороди, завідувач кафедри валеології, м. Харків
Захист відбудеться “22” січня 2008 р. о “1330” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
Автореферат розісланий “19” грудня 2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження, спрямовані на створення ефективної технології низькотемпературного консервування кров’яних пластинок, ведуться упродовж декількох десятиліть. Проте, значних успіхів у даному напрямку досягти не вдалося. Як було зазначено провідними вченими на Міжнародному симпозіумі з кріоконсервування тромбоцитів крові людини (Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 1998), емпіричний підхід, на якому базувалися такі дослідження, не дозволив розробити метод кріоконсервування тромбоцитів, що задовольнив би клініцистів за рівнем їх лікувальної ефективності та безпечністю кріоконсерванта для реципієнта. Є нагальна потреба у дослідженні факторів, що можуть впливати на життєздатність кров’яних пластинок на всіх етапах технологічного процесу низькотемпературного консервування – від виділення концентратів тромбоцитів до їх застосування, із залученням адекватних та інформативних методів оцінки структурної цілісності та функціональних властивостей клітин [ReidT.J. etal., 1999; GaoD. etal., 1999; CroweJ.H. etal., 1999; WoodsE.J. et al., 1999; Dijkstra-TiekstraM.J. et al., 2003; BalintB. et al., 2006].
Диметилсульфоксид (ДМСО) у кінцевій концентрації 5 – 6 % забезпечує найбільш високий рівень морфофункціональної збереженості кров’яних пластинок порівняно з іншими кріопротекторами, тому спосіб заморожування з ним визнаний “золотим стандартом” [ReidT.J. andGaoD., 1999]. Однак, трансфузії кріоконсервованих з ДМСО концентратів тромбоцитів несуть небезпеку виникнення у реципієнта серйозних побічних ефектів [CurcoyA.I. etal., 2002]. Обов’язковим є етап видалення ДМСО із суспензії відігрітих клітин, що супроводжується додатковими кількісними втратами кров’яних пластинок та зниженням їх функціонального потенціалу. Існуючі модифікації методу заморожування тромбоцитів з ДМСО [LozanoM. L. etal., 2000; ValeryR.C. et al., 2005] дають можливість уникнути процедури видалення кріопротектора, але не дозволяють повністю позбутися його токсичного ефекту. Диметилацетамід (ДМАЦ) менш токсичний, ніж ДМСО, але поступається йому за кріозахисними властивостями [Компаниец А.М., 1980; 1992; Азовская С.А. и др., 1989]. Щодо 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) існують протилежні думки: одні автори вважають дану сполуку перспективною при кріоконсервуванні тромбоцитів [Компаниец А.М. и др., 1992], інші наголошують на її слабкій кріозахисній дії [ArnaudF.GandPeggD.E., 1990]. Таким чином, проблема вибору кріопротектора та визначення оптимального за складом кріозахисного середовища для кріоконсервування тромбоцитів потребує подальшого вирішення.
Як доведено дослідженнями останніх років [BalintB. etal., 2006; BilynetsT. etal., 2006; Kyryliuk еtal., 2006], швидкість охолодження біологічного об’єкта повинна підбиратися з урахуванням конкретних фізико-хімічних явищ і процесів, що спостерігаються в різних температурних інтервалах. Саме тому існуючі програми заморожування кров’яних пластинок, що підбиралися емпірично, потребують перегляду і розробки рекомендацій щодо їх оптимізації.
Дослідження впливу факторів кріоконсервування є актуальними і мають стати основою теоретично і експериментально обґрунтованої стратегії низькотемпературного консервування концентратів тромбоцитів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом НДР ІПКіК НАН України у відділі кріопротекторів в рамках теми 2.2.6.95 “Вивчення ефективності етоксилатів поліолів (метил- і амідозаміщених) в якості кріопротекторів для кріоконсервування компонентів крові, клітин і тканин фетоплацентарного комплексу людини і тварин”, номер держреєстрації 0101U003481; теми 2.2.6.30 “Вивчення закономірностей кріозахисної дії та токсичних властивостей багатокомпонентних середовищ на основі нових кріопротекторів рядів поліолів і амідів при кріоконсервуванні клітин і загальному охолодженні організму гомойотермних тварин”, номер держреєстрації 0106U002166.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – дослідити вплив ряду факторів кріоконсервування на збереженість структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів на етапах низькотемпературного консервування.
Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:
1. Дослідити у порівняльному аспекті ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з донорської крові двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми та лейко-тромбоцитарного шару, за умови подовження терміну їх зберігання перед заморожуванням до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єС.
2. Вивчити антирадикальні властивості кріопротекторів різних класів хімічних сполук за здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі та дослідити їх вплив на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
3. Дослідити вплив кріопротекторів: диметилсульфоксиду, диметилацетаміду та 1,2-пропандіолу на структурну цілісність і функціональні властивості тромбоцитів на етапі експозиції.
4. Визначити вплив швидкості охолодження кріобіологічної системи у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур на структурну цілісність та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів.
5. Оцінити ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу (диметилсульфоксид, диметилацетамід, 1,2-пропандіол, комбінації диметилацетаміду і 1,2-пропандіолу).
Об’єкт дослідження – зміни параметрів структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів крові людини під впливом факторів кріоконсервування.
Предмет дослідження – тромбоцити крові людини.
Методи дослідження – кріобіологічні, біохімічні, цитологічні, гематологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у порівняльному аспекті вивчено вплив комплексу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів, що були виділені з донорської крові двома методами – із збагаченої тромбоцитами плазми і лейко-тромбоцитарного шару та зберігалися перед заморожуванням протягом 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC.
Встановлено фактори, які мають визначальний вплив на ефективність кріоконсервування тромбоцитів – склад кріозахисного середовища та швидкість охолодження кріобіологічної системи в інтервалі кристалізації і зоні евтектичних температур. Вперше експериментально доведена доцільність використання при заморожуванні тромбоцитів комбінації кріопротекторів – ДМАЦ та 1,2-ПД. Теоретично обґрунтована і експериментально апробована програма заморожування концентратів тромбоцитів з оптимальними швидкостями проходження температурного інтервалу кристалізації. Вагомим підтвердженням важливості застосування розробленої програми охолодження є вперше встановлений факт збереження структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів при їх заморожуванні без кріопротектора, за умови поєднання процедури температурної ініціації кристалізації з наступною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC.
Вперше проведене порівняльне дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів різних класів хімічних сполук та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що характер впливу кріопротекторів на інтенсивність процесів ПОЛ у системі визначається, перш за все, їх хімічною природою, а не здатністю до перехоплення гідроксильних радикалів. Експериментально встановлено, що 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М не впливають на рівень пероксидації ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментально встановлена висока ефективність способу кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисному середовищі на основі комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М при застосуванні розробленої програми заморожування з контрольованою швидкістю охолодження у температурному інтервалі кристалізації, дозволяє рекомендувати його при подальшому створенні технології довгострокового зберігання тромбоцитів для клінічного застосування. Практичне значення для роботи низькотемпературних банків крові мають отримані у роботі експериментальні дані про можливість збільшення до 18 – 24 годин проміжку часу між виділенням і заморожуванням концентратів тромбоцитів (загальноприйнятий термін 4 – 6 годин) за умови їх зберігання при температурі 22 ± 2 єC і постійному перемішуванні. Розроблено новий спосіб максимального видалення кріопротекторів із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Показано, що для більш повної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування доцільним є застосування методу люмінесцентної мікроскопії, який базується на різній здатності кров’яних пластинок акумулювати акридиновий оранжевий (АО) в залежності від їх структурної цілісності та функціональних властивостей.