К признакам ответа на герпетическую инфекцию, помимо клинических симптомов, относятся микроскопические и иммунологические изменения:
– изменения состава крови (лейкопения, определяемая при общем анализе крови);
– появление гигантских клеток в зоне поражения (обнаруживаются в мазке или в мазке-отпечатке при исследовании в световом микроскопе);
– появление или рост числа антител к вирусу (обнаруживаются при помощи реакций антиген-антитело способами, описанными выше, с той разницей, что диагностикумы должны содержать не антитела, а антигены ВПГ).
Метод лабораторной диагностики является сочетанием нескольких этапов (подготовка пробы – проведение диагностических реакций – оценка результатов реакций), каждый из которых может быть осуществлен различными способами. Название метода обозначает, как правило, или объект исследования, или принципиальные особенности метода. Так, например, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает обязательное ферментативное «доращивание» ДНК ВПГ, идентификация которой в дальнейшем может быть проведена различными методами (электрофорез, генное зондирование, флюоресценция), а иммунофлюоресцентные методы детекции могут быть применены как в методе флюоресцирующих антител/антигенов, так и в иммуноферментных методах и т. д.
Доступность перечисленных методических подходов и их диагностическая ценность различны, что и определяет практическое значение различных способов лабораторной диагностики.
В настоящее время для диагностики герпетической инфекции применяют:
– цитологические исследования;
– вирусологические исследования;
– полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR);
– метод генного зондирования (молекулярная гибридизация, МД);
– реакции иммунофлюоресценции (РИФ, ИФ);
– иммуноферментный анализ (ИФА, ТФИФА или ELISA);
– радиоиммунный анализ (РИА);
– иммуноблоттинг (ИБ).
Цитологические исследования. Материал соскоба или отпечатка фиксируют на обезжиренном предметном стекле этиловым спиртом на 30–40 мин, высушивают и передают в лабораторию для окрашивания и исследования в световом микроскопе с целью выявления гигантских клеток. При интерпретации ответа лаборатории нужно иметь в виду возможность ложных диагнозов. Ложноотрицательный ответ может быть обусловлен неудачным забором материала — недостаточной глубиной погружения шпателя (ВПГ находится в клетках основания элемента поражения), ранними или поздними сроками заболевания (цитопатические эффекты проявляются спустя 24–48 ч после заражения и исчезают в стадии эпителизации). Ложноположительный диагноз может быть связан с наличием в клетках вируса ветряной оспы (дифференциация ВПГ-1, 2 и ВПГ-3 возможна только при иммунном анализе) или с наличием ВПГ-1, 2, которые в данном случае не являются причиной данного заболевания, но репродуцируются в ходе субклинического рецидива хронической герпетической инфекции.
Вирусологическое исследование продолжает оставаться «золотым стандартом» лабораторной диагностики ВПГ, хотя чувствительность метода не всегда достаточно высока. Для проведения этого метода забирают содержимое везикул, соскобы с пораженной СОПР или жидкость после полоскания полости рта, затем помещают материал в пробирку со стерильным физиологическим раствором и передают ее в лабораторию. Следует учитывать длительное сроки исследования (даже современные «быстрые» исследования занимают как минимум 48 ч).
Полимеразная цепная реакция. Материал для проведения ПЦР забирают так же, как и для вирусологического исследования. Метод является высоко чувствительным, поэтому, с одной стороны, позволяет обнаружить минимальное количество вируса (единичную молекулу ДНК!) и строго идентифицировать его, а с другой стороны, — может дать ложноположительные результаты при загрязнении (контаминации) исследуемого материала в лаборатории. Фактическая чувствительность ПЦР варьирует в зависимости от качества реактивов и исполнения (от 30 до 90 %).
Метод генного зондирования для диагностики герпесвирусов часто применяется в сочетании с радиоиммунным анализом, иногда после предварительного «подращивания» ВПГ. Метод позволяет обнаружить ВПГ в образцах сыворотки крови, в соскобах СОПР, слюны, эпителиоцитах. Материал передают в лабораторию в пробирках со стерильной средой 199. Результаты получают в течение 1–2 дней. Чувствительность метода достигает 90 %.
Реакции иммунофлюоресценции для выявления антигенов ВПГ. Материалом для исследования может служить мазок, мазок-отпечаток СОПР, крови. Препарат готовят на сухом обезжиренном стекле, высушивают и передают в лабораторию. Исследование длится 1–3 ч. Метод имеет чувствительность около 60–80 %.
Серологические исследования — иммунофлюоресцентный и иммуноферментный методы обнаружения антител к ВПГ имеют вспомогательное значение для ведения больных с герпетической инфекцией.
При первичной герпетической инфекции в иммунокомпетентном организме рост иммуноглобулинов выявляется поздно — только через 10–12 дней от начала заболевания. Выявление противогерпетического IgM без IgG, или четырехкратный рост количества IgG рассматривают как свидетельство первичной герпетической инфекции. Отсутствие антител к ВПГ или вялая динамика их роста не всегда означает отсутствие ВПГ-инфекции — причина может скрываться в недостаточной активности иммунитета ребенка.
С другой стороны, обнаружение антител к ВПГ нельзя рассматривать как доказательство причинной роли ВПГ в диагностируемой патологии ребенка из-за тотальной распространенности хронической герпетической инфекции в популяции: антитела у ребенка до полугода могут быть переданы матерью, у старших детей они могут быть выработаны в течение предыдущих эпизодов ВПГ-инфекции. Ориентиром может быть динамика титра антител: выявление IgM при стабильном содержании IgG свидетельствует о хронической герпетической инфекции, четырехкратный рост IgG в период от начала до конца эпизода заболевания можно рассматривать как ответ на рецидив этой инфекции.
Комплексные серологические реакции, повторяемые в ходе заболевания, помогают оценить качество иммунного ответа ребенка на ВПГ-инфекцию как на антигенную нагрузку. Однако, следует также помнить о том, что высокий титр противогерпетических антител не всегда гарантирует надежную защиту ребенка от суперинфекции новым штаммом ВПГ: основную массу антител при персистентной инфекции составляют группо- и типо-специфические антитела, тогда как эффективными в борьбе с конкретным штаммом ВПГ оказываются лишь гаплотипоспецифические антитела; выделить их из общего пула при помощи коммерческих тест-систем не представляется возможным.
Серология помогает выявить пациентов, которые способны дать тяжелые рецидивы при глубокой иммуносупрессии. Серологические тесты, в частности, используются перед пересадкой органов или костного мозга, для того, чтобы пациенты с положительной ВПГ-серологией получили профилактическую противовирусную поддержку.
Таким образом, для успешной лабораторной экспресс-диагностики герпетической инфекции следует планировать одновременное исследование материала, взятого из нескольких зон поражения, различными способами.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Анохин, В. А. Современные принципы клинико-лабораторной диагностики герпетических инфекций / В. А. Анохин // Казанский мед. журнал. 2000. № 2. С. 127–129.
2. Вирус простого герпеса и его роль в патологии человека / А. Г. Коломиец [и др.]. Мн.: Наука и техника, 1986. 262 с.
3. Вирусология. В 3-х т. Т. 1: пер. с англ.; под ред. Б. Филдса, Д. Найпа при участии Р. Ченока, Б. Ройзмана. М.: Мир, 1089. 452 с.
4. Вирусология. В 3-х т. Т. 3: пер. с англ.; под ред. Б. Филдса, Д. Найпа при участии Р. Ченока. Б. Ройзмана. М.: Мир, 1089. 452 с.
5. Германенко, И. Г. Простой герпес и новые герпесвирусы в патологии человека: методические рекомендации / И. Г. Германенко, А. П. Кудин. Мн.: БГМУ, 2001. 36 с.
6. Мельниченко, Э. М. Состояние слизистой оболочки полости рта при гриппе, парагриппе, аденовирусной инфекции и герпесе : автореф. дис. … канд. мед. наук / Э. М. Мельниченко. М., 1972. 18 с.